白介素-18对肝癌裸鼠皮下移植瘤浸润的CD4+T细胞子集的影响

史卫红，高胜利，宋祥和，卞勇华，Greg Brothers，李玉华，吴建成

(1.盐城卫生职业技术学院，江苏 盐城 224006;2.苏州大学 附属第一医院，江苏 苏州 215006;3.Department of Medical Biophysics，University of Toronto，Toronto，Ontario，Canada)

白介素-18(IL-18)具有诱导干扰素-γ(IFN-γ)产生、增强自然杀伤细胞(NK)和细胞毒性T细胞(CTL)细胞活性、诱导Thl细胞分化等多种生物学功能，具有强大的抗肿瘤作用［1］。Nagai等［2］将 IL-18转入黑色素瘤B16F10细胞株，发现转染IL-18能抑制移植瘤新生血管形成。近年来，IL-18的抑制肿瘤血管生成作用被一系列研究证实［3-4］。本实验中采用不同剂量的IL-18体内干预人肝癌细胞株HepG2肝癌裸鼠皮下移植瘤生长，流式细胞术检测肿瘤组织及脾组织中 IFN-γ+IL-17+CD4+T、Th17、Th1细胞，探讨IL-18影响肝癌裸鼠皮下移植瘤浸润的T细胞子集变化的机制。

1 材料

人肝癌细胞株HepG2由苏州大学肝病研究中心提供;IL-18，加拿大多伦多大学蛋白质中心实验室主任Greg Brothers教授提供;细胞培养基和胎牛血清(BSA)，杭州四季青公司;辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG抗体、DAB-HCL显色剂、过氧化氢甲醇溶液、羊血清，上海华美公司;淋巴细胞分离液(ficoll分离液)，上海华精生物公司;DMEM、新生小牛血清(FBS)、RMPI 1640培养基，Hyclone公司;佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)、离子霉素(ionomycin)，Sigma 公司;布雷菲德菌素A(brefeldin A，BFA)，Alexis公司;藻红蛋白(PE)标记抗鼠IL-17、异硫氰酸荧光素(FITC)标记抗鼠IFN-γ抗体，eBioscience公司。

免疫磁珠阴选试剂盒(Dynabeads Untouched Human CIM T细胞)，Dvnal公司;固定与透膜试剂盒(FIX/PERM)，Caltag公司。

FACS Calibur流式细胞仪，BD公司。

BALB/c裸鼠，雌雄各半，鼠龄5周，体重14.5～17.5 g，购于中国科学院上海动物中心，动物合格证号:SCXK(沪)2007-0005，在苏州大学新校区动物中心SPF级条件下由中心工作人员统一饲养。

2 方法

2.1 肝癌细胞培养及传代

冻存的 HepG2细胞复苏成功后，采用 RPMI 1640完全培养基，制备细胞悬液，37℃、5%CO2饱和湿度温箱中孵育，培养后第1天即可见细胞数的增加，第3～8天为指数增殖期，第10天达到最大密度。用0.25%胰蛋白酶(含0.01%EDTA)消化，制成细胞悬液，含细胞数 5.0 ×106个/0.1 mL，台盼蓝测定细胞活力在95%以上。

2.2 裸鼠肝癌皮下移植瘤模型的建立及给药

将HepG2细胞悬液0.1 mL注入裸鼠左前肢皮下，模型鼠分为4组，每组6只，分别腹腔注射IL-18 0.75，1.00，1.25，0(模型组)μg/只，给药体积均为0.1 mL，连续给药4周，观察裸鼠生长及成瘤情况。另设正常对照组，给予等体积的生理盐水。

2.3 HE染色

10%福尔马林固定裸鼠皮下移植瘤组织块，常规石蜡制片，切片厚度为4 μm，HE染色观察移植瘤组织病理变化。

2.4 裸鼠肿瘤生长情况观察以及皮下移植瘤组织淋巴细胞的分离

瘤细胞接种后观察裸鼠体重、精神状态、食欲、对外界的反应等，每次注射药物的同时，用游标卡尺测量肿瘤最大直径和最小直径。4周后用摘眼球法取血，用颈椎脱位法处死动物，剥离肿瘤和脾脏组织。取小块肿瘤组织浸入10%福尔马林溶液中留作病理检查。将获得组织块经RPMI 1640培养基洗涤去除血液，切成2～3 mm大小的组织块，放入50 mL离心管内，用RPMI 1640培养基洗涤2～3次(每次1 000 r/min离心2～3 min)，弃尽上清;加入适量消化液，37℃，80 r/min振荡消化30～60 min，1 500 r/min离心 5 min，弃上清，RPMI 1640或DMEM重悬，经120目钢丝网过滤，去除组织等，将收集到的细胞悬液5 mL涡旋后沿管壁缓慢加入含有Ficoll 5 mL的离心管中，重悬细胞，离心，吸取中间层细胞。

2.5 移植瘤组织CD4+T细胞的分离及胞内细胞因子检测

离心收集待分离细胞，用少量 PBE孵育液(0.5%BSA、0.08%EDTA、pH 7.2 磷酸盐缓冲液)充分混悬细胞，然后根据免疫磁珠阴选试剂盒操作说明分选出CD4+T细胞，流式细胞术测定纯度达90%以上。以含10%FBS的RPMI 1640培养液重悬细胞，显微镜下计数(终浓度为1×106/mL)。吸取细胞悬液200 μL至96孔平底细胞培养板内，在分离的淋巴细胞中分别加入10 μg/mL PMA l μL和100 μg/mL 离子霉素2 μL 以及 300 μg/mL BFA 22 μL，使其终浓度分别为50 ng/mL，1 μg/mL 和3 μg/mL，将细胞放在细胞培养箱内，37℃，5%CO2的条件下培养4～5 h。然后取细胞悬液100 μL，4℃避光孵育15 min，用 pH 7.4磷酸盐缓冲液(含0.1%NaN3和5%FBS)3 mL洗涤，离心弃上清，再加入透膜剂100 μL，反应5 min 1 800 r/min离心弃上清。用大鼠血清50 μL封闭10 min，pH 7.4磷酸盐缓冲液洗2次，分别加入PE-anti-mouse-IL-17和FITC-anti-mouse-IFN-γ 0.25 μL，室温避光 30 min，通透洗液洗2遍，以pH 7.4磷酸盐缓冲液200 μL重悬细胞后，上机检测，结果用cellquest软件分析。

2.6 统计学处理

所有数据均利用SPSS15.0统计软件包进行相关分析和统计，多组数据组间分析使用单因素方差分析(one way ANOVA分析)，率的比较采用卡方检验或Fisher确切检验;多个独立样本等级资料比较采用Kruskal-Walis H检验，两两比较采用Mann-Whitney-U检验:统计检验均为双侧概率检验(α=0.05)，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 裸鼠皮下移植瘤模型的建立及IL-18对肝癌皮下移植瘤重量、体积及抑瘤率的影响

HepG2细胞顺利培养并传代，成功建立鼠皮下移植瘤(图1)，其肿瘤标本切片病理提示均为肝细胞癌(图2);部分移植瘤坏死，出现肝脏转移灶。不同剂量组治疗组肿瘤重量显著轻于对照组(P＜0.05)，但是治疗组间比较无显著差异(P ＞0.05)，见图3，在后期实验中不同疗程组提示IL-18早期长疗程治疗效果更佳(将另文发表)。从不同剂量组肿瘤生长曲线(图4)可以看出，IL-18治疗组肿瘤体积生长明显比未治疗组慢，从两周时，已有统计学差异(P＜0.05)。随着剂量的增加，肿瘤体积愈小，抑瘤效果愈加明显，故后期不同疗程实验组采取最大组剂量治疗。

图1 不同剂量组裸鼠移植瘤比较Fig.1 Comparison with transplantation tumors between different dosage groups in nude mice

图2 皮下移植瘤(HE染色 ×400)Fig.2 Transplantation tumors intradermally(HE stain ×400)

图3 不同剂量组治后裸鼠瘤重柱形图Fig.3 Comparison with weight of transplantation tumors between different dosage groups in nude mice with histogram

图4 不同剂量组裸鼠瘤体积生长曲线Fig.4 Comparison with volume of transplantation tumors between different dosage groups in nude mice with growth curve

3.2 正常组皮下组织、脾组织及裸鼠移植瘤模型不同剂量组肿瘤组织、脾组织中CD4+T细胞子集的检测

IL-17+/IFN-γ+CD4+T细胞和Th17细胞在裸鼠移植瘤模型的肿瘤组织和脾组织中均升高;IL-18给药组CD4+T细胞中IFN-γ阳性细胞增多，而IL-17+/IFN-γ+CD4+T细胞和Th17细胞下降，治疗组间比较差异无显著性;但模型组、治疗组及正常对照组间比较差异均有统计学意义，见表1～2和图5。

表1 不同组CD4+T细胞子集在皮下组织和移植瘤中的表达(± s，n=6)Tab.1 CD4+T cell subset expression of subcutaneous tissue and transplantation tumor in different groups(± s，n=6)

表1 不同组CD4+T细胞子集在皮下组织和移植瘤中的表达(± s，n=6)Tab.1 CD4+T cell subset expression of subcutaneous tissue and transplantation tumor in different groups(± s，n=6)

与正常对照组比较:1P ＜0.05，2P ＜0.01;与模型组比较:3P ＜0.05，4P ＜0.01Compared with control:1P ＜0.05，2P ＜0.01;Compared with model group:3P ＜0.05，4P ＜0.01

组 别 剂量/(μg/只) IFN-γ+/% IFN-γ+IL-17+/% IL-17+/%正常对照组-10.43 ±0.87 0.82 ±0.27 2.35 ±1.73 IL-18 组 0.75 7.78 ±2.031，3 1.12 ±0.533 4.87 ±1.791，3 1.00 8.07 ±1.011，3 1.09 ±0.703 4.52 ±1.121，3 1.25 8.53 ±0.871，3 0.92 ±0.383 3.98 ±0.621，3模型组 0 5.35 ±1.322，4 2.33 ±0.821 6.05 ±2.152

表2 不同组CD4+T细胞子集在脾组织中的表达(± s，n=6)Tab.2 CD4+T cell subset expression of spleen tissues in different groups(± s，n=6)

表2 不同组CD4+T细胞子集在脾组织中的表达(± s，n=6)Tab.2 CD4+T cell subset expression of spleen tissues in different groups(± s，n=6)

与正常对照组比较:1P ＜0.05，2P ＜0.01;与模型组比较:3P ＜0.05，4P ＜0.01Compared with control:1P ＜0.05，2P ＜0.01;Compared with model group:3P ＜0.05，4P ＜0.01

组 别 剂量/(μg/只) IFN-γ+/% IFN-γ+IL-17+/% IL-17+/%正常对照组-11.43 ±2.07 1.02 ±0.32 2.45 ±1.03 IL-18 组 0.75 7.93 ± 2.031，3 1.12 ±0.833 4.67 ±1.761，3 1.00 8.57 ± 1.411，3 1.07 ±0.403 4.98 ±1.311，3 1.25 8.93 ± 1.921，3 1.03 ±0.593 4.39 ±1.061，3模型组 0 5.75 ± 1.802，4 2.37 ±1.021 6.23 ±2.142，4

图5 各组裸鼠组织中CD4+T细胞子集的表达Fig.5 CD4+T cell subset expression in each group

4 讨论

本研究以裸鼠为载体建立人肝癌动物模型，用不同剂量的IL-18抗裸鼠移植瘤治疗，取得了预期的效果(与实验前期予不同疗程IL-18抗裸鼠移植瘤疗效一致，数据将另外发表)。

Micallef等［5］研究发现，腹腔内和静脉内注射重组IL-18可引发机体对自体MethA肉瘤产生抗瘤效应，延长荷瘤鼠的生存期;Cao等［4］研究表明IL-18可抑制鸡胚胎的血管形成，在体内IL-18能特异性抑制纤维母细胞生长因子2(fibroblast growth factor-2)诱导引起的血管内皮细胞增殖;Ohtsuki等［6］发现，重组IL-18能上调鼠脾NK细胞Fas表达，提高Fas对靶细胞的敏感性，从而诱导Fas介导的肿瘤细胞凋亡。IL-18作为一种重要的免疫调节因子，可以刺激Thl细胞产生IFN-γ，促进Thl增殖及Fas介导的Thl细胞的细胞毒作用。但Yoshida等［7］把IL-18基因经病毒介导转染到接种胰癌细胞的裸鼠体内，并没有观察到抗肿瘤的效果。这些提示我们，IL-18对于多种肿瘤有抗肿瘤作用，但IL-18的抗肿瘤效应机制仍有争议［8-9］，IL-18抗肿瘤作用可能与个体差异或与肿瘤发生的组织、器官、细胞株有关。

本研究结果显示，IL-18能明显抑制裸鼠肝癌皮下移植瘤的生长，不同剂量治疗组裸鼠均生存良好，未出现明显不良反应。IL-18在治疗后第1周就已经显示其抑制肿瘤生长的作用，自第2周后抑制作用更明显，且剂量越大，疗程越长抑制作用更显著。

IL-18是一种重要的细胞正向免疫调节因子，在调节T细胞免疫平衡，发挥免疫监视功能起很重要的作用。Wakita等［10］在体外诱导，肿瘤抗原特异性Th17(αβCD4+T)或 Tc(αβCD8+T)可转化为 IFN-γ+T细胞，当迁移进产生肿瘤的裸鼠后，可根除肿瘤细胞。Th1主导的免疫效应能克服强烈的免疫抑制，能完全治愈鼠诱导产生的肿瘤。因此，本研究通过不同剂量IL-18治疗诱导IFN-γ的产生，检测CD4+T细胞子集在各组肿瘤组织、脾脏组织和正常对照组中的变化。

Sutton 等［11］研究发现，在缺乏 IFN-γ 时 CD4+T细胞可分化为产生IL-17的Th17细胞，IL-17的生成产生正反馈作用，放大Th17的反应和自身免疫性疾病。而IL-18通过诱导IFN-γ的生成促进Th1细胞的生成，呈正反馈效应放大Th1及其细胞因子的生成，发挥机体的免疫监视功能［12］。

在肿瘤微环境中，IL-17可能通过上调一些血管源性因子，促进肿瘤组织新生微血管的形成，加剧了肿瘤的病理进展［13］。Wakita 等［10，14］通过裸鼠实验模型证明IL-17可能通过促进血管生成，促进肿瘤的生长、侵袭与转移;并通过分子调节机制放大Th17细胞生成，抑制IFN-γ生成，下调细胞毒活性。

本研究发现，模型组肿瘤组织和脾组织中Th17细胞和IL-17+IFN-γ+CD4+T细胞显著增加，通过外源性IL-18治疗明显抑制皮下裸鼠移植瘤的生长和转移，各组织中IL-17+IFN-γ+CD4+T细胞数量减少，随着给药剂量的增加和时间的延长，Th17细胞数量呈逐渐减少趋势，但其机制还不清楚。可能IL-17+IFN-γ+CD4+T细胞在肿瘤环境中增加与Th17细胞分化有关，而IL-18可能通过诱导IFN-γ抑制其作用促进其向Th1细胞的转化，研究结果也提示给予IL-18后，IFN-γ在组织中增加。Thl7细胞在肿瘤免疫中的作用还存在着争议［15-16］，或许Th17细胞具有多效性，依据肿瘤的类型及免疫能力等而发挥促进或抑制肿瘤的功效。

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