通心络对糖尿病大鼠心肌纤维化的防治作用

王小梅，穆长征，赵田田，杨颖婷

(1.辽宁医学院 附属第一医院，2.辽宁医学院，辽宁 锦州 121001)

糖尿病心肌病是糖尿病的微血管病变之一，独立于高血压和冠状动脉病变发生，1972年由Rubler首次提出，其发病机制比较复杂，可能与能量代谢异常、氧化应激、肾素-血管紧张素系统激活、炎症反应等有关，病理改变包括细胞凋亡、心肌肥大和心肌纤维化等。近年来研究发现心肌组织转化生长因子-β1(TGF-β1)/Smad信号通路活化与糖尿病心肌病的发病有密切关系［1-2］。通心络胶囊是根据中医络病理论研制而成的含多种虫类的中药复方制剂［3］，临床用于治疗冠心病心绞痛取得良好疗效，并在高血压大鼠和病毒性心肌炎小鼠发病过程中具有明显抗心肌纤维化作用。超微粉碎(干粉)的通心络是对通心络胶囊中动物药进行超微粉碎，有利于有效成分的溶解和释放，使中药的生物利用度更高、吸收更充分、药效更好［4］。本研究将通心络干粉用于链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠，观察其对糖尿病大鼠心肌组织中TGF-β1、Smad3和Smad7的表达的影响，探讨通心络对糖尿病大鼠心肌纤维化的防治作用及可能的机制。

1 材料

通心络干粉(主要由人参、水蛭、全蝎、蜈蚣、土鳖虫、赤芍、蝉蜕、冰片组成)，每1 g干粉相当于生药1.43 g，河北以岭医药研究院，批号:070406。

兔抗鼠 TGF-β1、Smad3、Smad7抗体，北京博奥森生物有限公司。

引物合成设计由大连宝生物工程有限公司进行引物合成。

血糖测定仪，美国强生公司SureStep Plus(稳步倍加型);CTAS-1000细胞图像分析仪，北京大恒图像视觉有限公司。

健康雄性SD大鼠，鼠龄7～8周，体重180～220 g，由辽宁医学院实验动物中心提供，合格证号:SYXK(辽)2005-0013。

2 方法

2.1 糖尿病模型的建立、分组及标本取材

SD大鼠40只，其中10只作为正常对照组(注射等量0.5 mol/L枸橼酸钠缓冲液)，另外30只尾静脉注射1%STZ溶液(用 pH 4.5，0.5 mol/L枸橼酸钠缓冲液配制)45 mg/kg。72 h后尾静脉取血测定血糖，以血糖浓度大于16.7 mmol/L定为糖尿病模型建立标准。将糖尿病大鼠随机分为2组:糖尿病模型组和通心络组。参照文献［5］，通心络组给予通心络干粉0.5 g/kg，溶于水中后灌胃给药，正常对照组和糖尿病模型组灌胃相同体积的水，共12周。12周末，称体重，腹腔注射20%乌拉坦溶液0.5 mL/100 g麻醉，取心脏，4℃生理盐水漂洗后滤纸吸干全心称重，去除心房、右心室，称左心室重，将左室心肌标本横切分为两份，中下段冻存于－80℃冰箱，用于RT-PCR检测。左室中上段取5 mm3心肌组织，迅速放入10%甲醛溶液中固定，石蜡包埋切片用于光镜及TGF-β1，Smad3和Smad7蛋白的免疫组织化学测定。

2.2 血糖、心脏重量指数、左室重量指数测定

尾静脉取血，血糖仪及血糖测定试纸测血糖。计算大鼠心脏重量指数(全心重量/体重)和左心室重量指数(左心室重量/体重)。

2.3 胶原容积积分(CVF)测定

取心肌组织5 mm3，迅速放入10%甲醛溶液中固定后组织脱水，石蜡包埋，制备组织切片行HE染色及VG胶原染色(在VG染色下，心肌细胞、红细胞呈黄色，间质胶原纤维呈红色)。镜下观察心肌组织病理形态学变化，图像分析仪测量CVF。

2.4 免疫组化测定心肌中TGF-β1、Smad3及Smad7的蛋白表达

心肌组织切片常规二甲苯、梯度乙醇脱蜡、抗原修复，血清封闭，滴加一抗，4℃冰箱过夜，滴加二抗，DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，封片。显微镜下见棕黄色为阳性表达。每组标本切片随机选取10个高倍视野，采用CTAS-1000细胞图像分析仪计算各组阳性表达平均灰度值，进行分析。

2.5 RT-PCR 法检测 TGF-β1、Smad3、Smad7mRNA表达

取－80℃冻存的心肌组织，置入盛有液氮的研钵中，加入Trizol 1 mL，用研磨棒仔细研磨，抽取匀浆，提取总RNA。按照RT-PCR试剂盒说明书进行RT-PCR检测。TGF-β1的引物:上游:5'ATGGTGGACCGCAACAAC3'， 下 游:5'TGAGCACTGAAGCGAAAGC3'，扩增片段长度为329 bp;Smad3的引物:上游:5'GATGTGGCTGGGAAATAC3'，下游:5'TTCTAGTCAGTCTGCCTGTAC3'，扩增片段长度为74 bp;Smad7的引物:上游:5'CCCTTTGGATCAGCATTTC3'，下游:5'GGTTCTGGTTCAGCCTTCTA3'，扩增片段长度为 345 bp;β-actin的引物:上游:5'GAAATCGTGCGTGACATTA3'，下 游:5'GGACTCATCGTACTCCTGCT3'，扩增片段长度为 477 bp。PCR反应条件:94℃预变性5 min;94℃ 30 s;退火30 s;72℃延伸30 s，72℃ 7 min，4℃保存，33个循环。取PCR产物5 μL在2%琼脂糖凝胶上电泳，结果在凝胶成像系统上扫描，通过图像分析系统测定光密度值检测 TGF-β1、Smad3、Smad7mRNA 表达相对含量。

2.6 统计分析

用SPSS13.0统计软件包进行数据处理，数据用(x±s)表示，组间比较采用方差分析，组间两两比较用q检验。

3 结果

3.1 大鼠一般情况

注射STZ后，大鼠逐渐出现多尿、多饮、多食等糖尿病症状，体重增长缓慢，伴有不同程度的精神萎靡，皮毛稀疏无光泽，2只大鼠血糖低于16.7 mmol/L，弃去，至实验末糖尿病模型组大鼠因感染或糖尿病加重死亡2只;通心络组死亡1只，其余25只大鼠均达到成模标准。

3.2 通心络对糖尿病大鼠血糖、心脏重量指数和左心室重量指数的影响

12周时，糖尿病模型组大鼠血糖明显高于正常对照组，心脏重量指数和左心室重量指数明显升高;通心络组与糖尿病模型组相比，血糖无明显差异，心脏重量指数和左心室重量指数明显降低，但仍高于正常对照组，见表1。

3.3 CVF 的变化

与正常对照组相比，糖尿病模型组大鼠CVF明显增高;与糖尿病组相比，通心络组CVF明显降低，但仍高于正常对照组，见表1。

3.4 大鼠心肌TGF-β1、Smad3及Smad7的蛋白表达

正常对照组大鼠心肌TGF-β1、Smad3的蛋白表达在心肌细胞浆中、细胞外周、血管周围出现棕黄色颗粒物质，呈弱阳性改变，而Smad7的蛋白表达呈强阳性;糖尿病模型组大鼠心肌TGF-β1、Smad3的蛋白表达呈强阳性，而Smad7表达明显减少;与糖尿病模型组比较，通心络组TGF-β1、Smad3表达明显减少而Smad7表达明显增多。见表2。

3.5 大鼠心肌 TGF-β1、Smad3、Smad7mRNA 的含量测定

与正常对照组比较，糖尿病模型组 TGF-β1、Smad3mRNA表达显著增强，Smad7mRNA表达显著下降;与糖尿病组相比，通心络组 TGF-β1、Smad3mRNA表达显著降低，Smad7mRNA表达显著增高。见表3和图1。

表1 三组大鼠血糖、心脏重量指数、左心室重量指数及CVF的比较(x±s)Tab.1 The comparison of blood glucose，heart weight index，left ventricular weight index and CVF in the three groups(x±s)

表2 三组大鼠心肌TGF-β1、Smad3、Smad7蛋白表达比较(x±s)Tab.2 The expression levels of TGF-β1，Smad3，Smad7protein in the three groups(x±s)

表3 三组大鼠心肌TGF-β1、Smad3、Smad7mRNA表达比较(x±s)Tab.3 The expression levels of TGF-β1，Smad3，Smad7mRNA in the three groups(x±s)

4 讨论

糖尿病心肌病是糖尿病的严重并发症之一。近年来的研究发现，心肌间质胶原纤维沉积和心肌纤维化是糖尿病心肌病变的一种重要特征，心肌纤维化增加了心室壁僵硬度，降低了心室顺应性，致心室舒缩功能障碍，早期以舒张功能障碍为主，最后发展为收缩功能不全。有研究表明，TGF-β1过度表达可促进心肌纤维化和心肌肥厚而导致心室重构，参与心肌纤维化发生的早期过程［6］。TGF-β1是一类多功能细胞因子，在纤维化的发生、发展过程中起着重要重要，是组织器官纤维化的主要调控因子之一［7］，其高表达具有促组织发生纤维化的病理作用，它可促进细胞外基质的合成与分泌，减少细胞外基质的降解;增加胶原与基质蛋白的生成;最终导致心肌细胞外基质的沉积，从而引起心肌纤维化［8］，本研究结果显示，糖尿病模型组大鼠心肌TGF-β1、TGF-β1mRNA的表达水平显著高于对照组，说明糖尿病大鼠心肌纤维化可能与 TGF-β1过度表达有关，该结果与章怡袆等［9］的结果一致。而通心络组TGF-β1表达有所减少，说明通心络可降低糖尿病心肌病中TGF-β1的表达，从而缓解糖尿病心肌病的发生与发展。

图1 RT-PCR观察鼠心肌组织TGF-β1mRNA(A)、mad3mRNA(B)和mad7mRNA(C)表达Fig.1 The expression of TGF-β1mRNA(A)，mad3mRNA(B)and mad7mRNA(C)in heart muscle tissue with the way of RT-PCR

Smad作为TGF-β1的细胞内信号转导蛋白，同样参与了糖尿病心肌病病理改变。已有研究证实心脏Smad可能在新生血管形成、心肌肥厚和心力衰竭中发挥重要作用，其中，Smad7为抑制性Smads蛋白(I-Smads)，被认为是TGF-β1信号转导通路上最重要的负性调节因子之一，可与Smad2、Smad3竞争性结合 TGF-β1，阻止 Smad2、Smad3磷酸化而阻断TGF-β1信号向下传导［10-11］。本研究观察到，糖尿病大鼠心肌Smad3、Smad3mRNA表达增加，而Smad7、Smad7mRNA的表达减少，提示Smad3可能参与了糖尿病心肌病的发生发展过程，Smad7通过对TGF-β1信号转导通路上最重要的负性调节，使TGF-β1表达减少，从而起到对糖尿病心肌病的保护作用。通心络干粉主要由人参、水蛭、全蝎、蜈蚣、土鳖虫、赤芍、蝉蜕、冰片组成，赵田田等［12］通过实验发现通心络降低心肌基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、组织型基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)与TGF-β1蛋白的表达及含量，起到预防糖尿病心肌纤维化的作用，而本研究发现通心络组明显上调Smad7、Smad7mRNA的表达，下调Smad3、Smad3mRNA的表达，表明通心络可影响 TGF-β1的细胞内信号转导，通过下调TGF-β1、Smad3的表达和上调 Smad7表达，减轻心肌纤维化，进而对糖尿病大鼠心肌组织起到保护作用。由于通心络的配方是含多种虫类中药的复方制剂，目前尚不清楚发挥上述作用的是单一成分还是复合成分，有待于进一步研究。

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