十二指肠胃反流对大鼠胃黏膜损伤机制的研究

张艳丽 ，姚树坤 ★，刘俊宝

（1.中日友好医院 消化内科，北京 100029，2.北京朝阳三环肿瘤医院，北京 100122）

十二指肠胃反流（duodenogastric reflux，DGR）可直接造成胃黏膜损伤，严重者造成胆汁反流性胃炎甚至诱发细胞癌变[1，2]。十二指肠反流液由胆汁、胰液和十二指肠液组成，哪种成分导致黏膜炎症，还是多种成分协同作用加重黏膜损伤，目前机制尚不明确。我们成功引流SD大鼠的胆汁或十二指肠混合液（包括胆汁+胰液+十二指肠液），再将引流液灌胃建立SD大鼠DGR模型，观察胃黏膜病理改变、细胞因子表达和细胞凋亡的规律，为阐明DRG胃黏膜损伤机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

手术组包括成年SD大鼠16只，体质量200～250g，雌雄各半，随机分为引流胆汁组（n=8）和引流十二指肠混合液组（n=8）。前组进行肝总管插管手术，后组进行十二指肠插管手术，术后分别制备并收集胆汁和十二指肠混合液 （包括胆汁+胰液+十二指肠液）。此外成年SD大鼠24只，体质量200～250g，雌雄各半；随机分成 A、B和 C组，各8只。A组行胆汁灌胃造模，B组行十二指肠混合液灌胃造模，C组行生理盐水灌胃。所有大鼠由河北医科大学实验动物中心提供，动物等级Ⅱ级，合格证编号DK0407-0049。

1.2 造模方法

1.2.1 胆汁或十二指肠混合液的制备和收集

①胆汁的收集和制备：SD大鼠术前禁食24h不禁水，2%戊巴比妥钠0.2ml/100g腹腔注射麻醉，局部碘伏消毒，取剑突下及腹中线作约3cm的切口切腹，翻起肝脏后，在门静脉一侧看到1根黄色透明的管道即肝总管，分离肝总管，在其壁剪一小口，插入聚乙烯管，可见黄色的胆汁流出，导管结扎固定。肝肠复位，关腹前腹腔内注入温生理盐水1ml，逐层缝合腹膜、肌层和皮肤，引流管末端插入10ml塑料离心管内收集胆汁，收集导管固定在动物背部。②十二指肠混合液的收集和制备：SD大鼠的准备、麻醉和切腹过程同上，翻起肝脏后，找到胃幽门与十二指肠交界处，在十二指肠距幽门约1cm处剪口，插入聚乙烯管引流胃液，结扎十二指肠上端，固定及缝合。在十二指肠远端10cm处的肠壁上剪口，此处插入2根聚乙烯管，一根引流胆汁+胰液+十二指肠液，另一根定时定量（2ml/4h）注入葡萄糖-盐水及纯牛奶，以维持大鼠生命活动。导管均结扎固定。肝肠复位、关腹、收集导管固定方法均同前。将收集到的胆汁和十二指肠混合液分别保存于小塑料管，置于-20℃冰箱内保存待用。

1.2.2 DGR动物模型的建立

将收集的胆汁和十二指肠混合液分别给A组和B组大鼠灌胃，制备不同DGR模型，自灌胃前1d起，每天18：00供大鼠标准鼠料15g/只，正常饮水。 每天 8：30、11：30、14：30 和 17：30 按照0.3ml/100g体重给大鼠灌胃，共14d。C组为对照组大鼠，给予同等量生理盐水灌胃。

1.3 主要试剂

细胞凋亡检测试剂盒，一抗TNF-α、抗IL-1β和抗IL-4，生物素标记的二抗IgG工作液，SP试剂盒及DAB显色剂均购于北京中山生物技术有限公司（Santa cruze公司产品）。

1.4 实验方法

1.4.1 引流液的pH值、总胆汁酸、胰淀粉酶测定

各取胆汁引流液和十二指肠引流液10ml，用pH监测仪测值；再分别各取2ml采用免疫荧光法测定总胆汁酸、胰淀粉酶的含量。

1.4.2 标本的处理

3组大鼠均灌胃14d，d15断头方法处死大鼠。剖腹取胃，自幽门向上剪开胃，肉眼观察大体病理改变，遂将胃分割为胃底、胃体和胃幽门三部分，每部分标本置于福尔马林内固定，石蜡包埋，做厚5μm连续切片，分别用于：HE染色光学显微镜观察、免疫组织化学研究和细胞凋亡检测。

1.4.3 胃黏膜病理观察

石蜡切片脱蜡后，行苏木素-伊红染色（HE染色），在光学显微镜下，进行低倍和高倍镜下观察。

1.4.4 免疫组化法观察TNF-α、IL-1β和IL-4的表达

主要步骤如下：石蜡切片脱蜡至水；3%甲醛-双氧水室温孵育10min，以消除内源性过氧化物酶的活性；抗原修复时滴加10%正常山羊血清封闭游离的结合位点，滴加PBS缓冲液1：100稀释的一抗（分别为抗TNF-α、抗IL-1β和抗IL-4的抗体），4℃冰箱过夜；滴加生物素标记的二抗IgG工作液 （羊抗鼠），37℃孵育 30min；DAB显色；复染；酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。阴性对照用PBS替代一抗，其余步骤同上。

结果判定：所有标本均在Motic Med 6.0数码医学图像分析系统内在相同的放大倍数下观察，TNF-α、IL-1β和IL-4在胃黏膜组织上皮细胞的细胞浆内表达，呈棕黄色或黄色，即阳性表达。参照El-Assal[3]及Ohmori[4]描述的方法计算TNF-α、IL-1β 和 IL-4 的表达指数（expression index，EI），即阳性目标平均光密度×阳性目标面密度×100%，其中阳性目标平均光密度为抗原表达的强度，在监视器上越亮，染色越深；阳性目标面密度表示阳性目标总面积/统计场面积，值越大阳性目标占的比例越大。

1.4.5 TUNEL法检测细胞凋亡

大鼠胃黏膜组织切片常规脱蜡至水。用蛋白酶K室温孵育15～30min后，加TUNEL反应混合溶液标记，在湿盒中孵育60min。信号转化和分析，擦干样品周围的水分，加入50μl转化剂-POD，在湿盒中37℃孵育30min。PBS冲洗3次，加入50～100μl DAB底物溶液，室温孵育10min，PBS冲洗3次。封片后在光镜下分析结果。

结果判定：所有标本均在Motic Med 6.0数码医学图像分析系统内在相同的放大倍数下观察，细胞核内有棕色或棕褐色颗粒弥漫分布者为阳性凋亡细胞[5]。每张切片观察500个以上胃黏膜上皮细胞，计算每100个上皮细胞中阳性凋亡细胞数，即凋亡指数（apoptosis index，AI）。

1.5 统计学处理

统计学分析采用SPSS12.0软件。组间比较采用单因素方差分析，计量资料比较采用t检验。

2 结果

2.1 手术组大鼠引流液pH值、总胆汁酸及胰淀粉酶测定

胆汁引流组的pH值低于十二指肠混合液引流组（6.9 vs 7.8，P＞0.05），胆汁引流组的总胆汁酸明显高于十二指肠混合液引流组 （477.9±44.71μmol/L vs 329.6±60.31μmol/L，P＜0.05），胆汁引流组未检测到胰淀粉酶，而十二指肠混合液中胰淀粉酶测定为8784.4±1825.63U/L。

2.2 光镜下形态观察

C组大鼠的胃黏膜组织未见明显异常。DGR模型大鼠A组和B组胃黏膜均可见不同程度的炎性改变，主要限于黏膜浅层，呈弥漫性或灶状分布。胃黏膜炎细胞浸润主要淋巴细胞和浆细胞，也可见少量嗜酸性粒细胞。此外可见固有膜平滑肌纤维和胃小凹增生。A组和B组均造模成功，但两组的胃黏膜病理学改变无明显差异。

2.3 大鼠胃黏膜细胞TNF-α、IL-1β和IL-4的表达

TNF-α主要表达于胃腺颈部及底部细胞浆中，呈黄色或棕黄色。IL-1β表达主要在胃腺颈部及底部细胞浆中表达，呈黄色或棕黄色。IL-4表达主要表达于胃腺颈部及底部的细胞浆内表达，呈黄色或棕黄色。表1示，A组和B组的TNF-α、IL-1β的EI均显著高于C组（均P＜0.05）。3组间的IL-4的EI比较无统计学差异（P＞0.05）。

表1 各组大鼠胃黏膜细胞因子表达的比较（±s）（n=8）

表1 各组大鼠胃黏膜细胞因子表达的比较（±s）（n=8）

注：与对照组比较，*P＜0.05。

EI A组（DGR模型） B组（DGR模型） C组（对照）TNF-α 2.08±1.40* 1.95±1.01* 0.75±0.39 IL-1β 2.72±0.40* 2.77±0.99* 1.15±0.50 IL-4 2.36±0.04 2.76±0.01 2.26±0.89

2.4 各组大鼠胃黏膜细胞凋亡情况

C组大鼠胃黏膜凋亡细胞主要位于胃底腺颈部表面，呈单个散在分布。A组和B组的大鼠胃黏膜凋亡细胞在黏膜全层均可见，主要位于胃底腺颈部，分布密集，形成凋亡细胞带。凋亡细胞呈棕褐色，体积小，形态呈浓缩或碎点状，不规则，大小不一致，周围无炎症反应。非凋亡细胞被苏木素复染成蓝色，核较大，形态大小较为一致。A、B和C 组的 AI分别为 16.29±4.87、16.62±4.71 和 3.45±2.21，其中A组和B组的AI均显著高于对照组（P＜0.05），而 A、B 组间无统计学差异（P＞0.05）。

3 讨论

以往的实验研究中DGR动物模型多采用胃空肠吻合术使十二指肠液反流入胃内[6]，但解剖学的改变不能模拟人类的原发性DGR。而本研究成功地将细聚乙烯管插入大鼠的肝总管和十二指肠，分别引流出胆汁或胆汁+胰液+十二指肠液的混合物，再进行灌胃制成DGR模型。胃黏膜病理显示不同程度的炎性改变，提示造模成功。此原发性DGR大鼠模型的优点是：简单易行，保证了胃十二指肠解剖结构的完整性，很好地模拟人类原发性DGR的发病过程。

十二指肠胃反流液的主要成分和主要致病因素是胆酸盐成分，但目前公认的观点是胆汁+胰液+十二指肠液的黏膜损伤作用比单独胆汁损伤作用更大[7]。本研究中胆汁和十二指肠混合液分别灌胃所致胃黏膜炎症无明显差异，该结果与以往结论不一致，可能与本实验灌胃造模时间短、灌胃的引流液量较少有关。

以往的研究发现致炎性细胞因子和抑炎性细胞因子在慢性胃炎的发病中起到重要作用。其中TNF-α和IL-1β是2种具有多种生物学活性的细胞因子，尤其是机体炎症反应的重要介质[8]。很多研究显示，慢性胃炎的发生与TNF-α和IL-1β在胃黏膜组织的高表达密不可分[9]。TNF-α诱导中性粒细胞黏附及白细胞穿出血管壁，造成黏膜内皮细胞损伤，同时还可促进其他细胞因子的大量释放，进一步引起中性粒细胞活化、急性期蛋白生成和小血管内凝血，影响黏膜血氧供应，加重黏膜损害。而IL-1同样可促进炎性介质的释放，增强炎症反应。本研究结果显示DGR模型组的TNF-α和IL-1β表达明显高于对照组，进一步提示该细胞因子参与了DGR胃黏膜损伤过程。另外，IL-4作为一种抑炎性细胞因子，在DGR模型组和对照组的胃黏膜表达无明显差别。由此推断DGR胃黏膜损伤过程中可能有致炎性细胞因子和抑炎性细胞因子的共同参与，最后导致黏膜损伤进行性加重。

很多研究显示多种细胞因子对细胞的凋亡起调控作用。目前TNF-α对细胞的诱导作用已得到公认，可能是通过与靶细胞膜上特异性受体（TNFR）结合，激发细胞内的一系列信号通路，从而影响细胞凋亡[10]。而且近年来也有学者开始关注细胞凋亡在胃黏膜损伤过程中的作用[11]。本研究中，我们利用TUNEL法检测胃黏膜细胞凋亡，结果发现：对照组的细胞凋亡主要在黏膜表层散在分布，而DGR模型组呈连续分布或成堆出现，A组和B组的凋亡指数均明显高于对照组 （P＜0.05）。细胞凋亡的增加可导致胃黏膜的萎缩，可能是萎缩性胃炎发生的原因之一。另外，胃黏膜上皮细胞大量凋亡时，可能会有代偿性增殖加快，如果致凋亡因素长期慢性作用，细胞增殖过度而出现异常增殖甚至细胞恶性转化过程，那么细胞凋亡和增殖的调节紊乱可能是十二指肠胃反流造成胃黏膜损伤乃至细胞癌变的发病机制之一。

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