p53治疗白介素-1β诱导兔膝关节炎的实验研究

尤 欣，王 迁，张 婷，郑乐婷，唐福林

（中国医学科学院中国协和医科大学 北京协和医院 风湿免疫科，北京 100032）

1999年Sant等学者首次提出以基因传递为基础的滑膜切除或分子溶解方法[3]。即将介导细胞死亡因子或诱导凋亡因子 （如FAS配体等基因）[4]，通过载体，导入病变关节，对增殖的滑膜细胞发挥杀伤作用，从而减轻了RA动物模型的滑膜炎症。p53是最著名的抑癌基因，如果将野生型p53基因引入RA滑膜细胞，可能会起到基因滑膜切除的作用，具有一定的治疗价值。因此，本研究选用p53作为治疗因子，以腺病毒（adenovirus，Ad）为载体，以人白细胞介素（interleukin，IL）-1β诱导的兔膝关节炎模型和人RA-FLS为研究对象，探讨p53治疗炎症性关节炎的作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料

Ad-p53由深圳赛百诺公司赠送。动物：新西兰白兔，6 月龄，2.5～3.0kg，雌性，协和医院动物室提供。滑膜组织：取自6例做膝关节置换的RA患者滑膜组织。RA的诊断依据美国风湿病学院1982年诊断标准。主要试剂：细胞培养基：高糖DMEM、F-12（美国 Gibco公司）。 胎牛血清（美国Hyclone公司）。RT-PCR反应试剂：TRIzol Reagent（美国 Invitrogen 公司）、Random Hexamers（美 国 Promega 公 司）、M-MLV Reverse Transcriptase（美国 Promega 公司），dNTP、RNasin、TaqDNA polymerase、oligo-dT（bases）、琼脂糖、溴化乙锭、100bp DNA Ladder（华美生物工程公司）。抗体：p53鼠抗人单克隆抗体（北京中山生物技术公司）。DNA缺口末端标记细胞凋亡检测试剂盒，R＆D公司。IL-6 ELISA试剂盒：达科为公司。PCR引 物 ：p53（扩 增 产 物620bp）——上 游 ：5’TACTCCCCTGCCCTCAACAAGA3’， 下 游 ：5’CCACGGATCTGAAGGGTGAAATATTC3’；Tubulin（扩 增 产 物410bp）——上 游 ：5’CTCATCACAGGCAAGGAAGAT3’， 下 游 ：5’TTAAGGTTAGTGTAGGTTGGG3’。

1.2 方法

1.2.1 动物实验

复制兔关节炎模型：将MFG-hIL-1β-neo重组体转染的兔滑膜成纤维细胞系（HIG-82）培养、传代、筛选阳性细胞后，将3×105细胞分别注入12只兔双侧膝关节。具体方法参考[5]，随机分组，每组6只兔子。于造模后d5开始治疗实验。治疗组：右膝关节注入Ad-p53重组体1×1010，左膝关节注入等体积PBS；对照组：右膝关节注入Ad-LacZ+重组体1×1010，左膝关节注入等体积PBS。评价疗效：分别于治疗前及治疗后d3完成以下检测：测量膝肿胀关节直径，计数滑液中白细胞数目。处死兔子后，获取双侧膝关节滑膜组织，进行HE染色，光镜下观察滑膜病理组织学改变。

1.2.2 TUNEL法检测滑膜组织凋亡情况

按TUNEL试剂盒方法，参见R&D使用说明。荧光显微镜下观察，核仁呈现绿色荧光为染色阳性。

1.2.3 细胞培养和病毒转染

获取RA滑膜组织，剪碎，加入胶原酶2mg/ml消化2h，滤过，PBS洗后种植于25cm2培养瓶，加入DMEM培养基+10%FCS，放入CO2孵箱。3～5d后细胞90%融合，用0.25%胰酶消化传代。于病毒感染前一天接种一定量的细胞，按一定的MOI（10，100）计算所需的病毒量，用PBS稀释至一定体积。弃去原培养基，冲洗，加入一定体积的稀释好的病毒液，37℃，CO2孵箱中培养3h，后加入完全培养基。

全力推进重点工程建设。一是完成锦凌水库、青山水库、应急入连工程、长海县引水工程收尾工作；推进猴山水库、观音阁水库输水等续建项目建设。二是完成清河、汤河水库加固工程竣工验收和四道号水库加固主体工程建设。抓好水闸、水库除险加固和降等报废工作。三是开工建设23个中小河流、15个主要支流和独流入海河流治理项目，治理水土流失面积300万亩。实施大伙房水库水源保护区综合治理工程。四是完成200万亩节水滴灌主体工程建设。解决120万农村人口饮水安全问题。改造7座大中型灌区、248座泵站；发放移民直补资金3亿元，完成移民项目369个。

四氮唑蓝比色法（MTT）检测细胞活性：MTT工作液（0.5mg/mlMTT in PBS）150μl/孔。流式细胞仪检测细胞周期：PI染色。

1.2.4 检测p53蛋白表达和FLS产生IL-6的水平

ELISA法收获RA-FLS上清，按照达科维公司试剂盒使用说明书操作，检测IL-6水平。

逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）分析：提取滑膜组织总RNA，定量后逆转录，逆转录产物进行PCR，微管蛋白Tubulin为内对照。PCR条件：预变性 94℃、5min， 变性 94℃、30s， 退火 64℃、30s，延伸72℃、1min，35次循环，后延伸72℃，10min，4℃保存。2.0%琼脂糖凝胶电泳。

Western blot：收集 FLS，提取全蛋白，制 12%SDS-PAGE凝胶，上样，跑胶，电转至硝酸纤维素膜，封闭，先后加入一抗小鼠抗人p53、二抗羊抗小鼠IgG孵育，洗膜，加ECL显色，凝胶成像系统扫描成像（FluorChemTMIS-8800，美国 Alpha In-notech公司），分析光密度值。

1.3 统计学方法

统计学处理应用SPSS10.0软件，组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 Ad-p53促进滑膜组织和FLS表达人p53mRNA和蛋白

Ad-p53转染兔膝关节的滑膜组织，于感染后不同时间提mRNA，逆转录后进行PCR分析，发现感染 Ad-p53后 （d1、d2、d3）， 滑膜组织 p53 mRNA表达明显上调，见图1。

分别于腺病毒重组体转染培养的人FLS后0、24h、48h和72h，收集细胞，进行Western blot检测p53，光饱和度分别为5.6%、11.4%、25.9%和57.1%，提示p53蛋白的表达随转染时间延长而增多，具有时间依赖性。见图2。

2.2 Ad-p53治疗兔膝关节炎模型的体内实验

将 hIL-1β-neo逆转录病毒转染的 3×105HIG-82细胞分别注入兔双侧膝关节，使其生理性表达和分泌hIL-1β，关节炎模型于24h内被成功复制。

Ad-p53治疗后的兔膝关节直径较治疗前明显减小，而注入Ad-LacZ的关节直径继续增加，治疗组与对照组比较， 差异显著 （P＜0.05）；Adp53治疗组的关节滑液转变为清亮，滑液量明显减少，而对照组的滑液仍呈脓性、粘稠、量多。细胞计数显示：治疗组滑液中白细胞数目较对照组明显减少1～2个数量级，见表1。治疗组的关节滑膜未见结节样增生，滑膜仅仅表现为轻度增厚，而对照组的关节滑膜则多为结节样增生。注入Ad-LacZ的关节与注入PBS的关节比较，以上关节炎的相关指标基本相同，无明显差异。

病理组织学分析结果显示：经Ad-p53治疗的滑膜组织较对照组明显变薄，但厚度不均一，炎症细胞（中性粒细胞和淋巴细胞）浸润明显减少，呈现慢性滑膜炎的改变。行组织TUNEL染色，滑膜边缘有部分滑膜细胞荧光染色呈弱阳性，未见明显滑膜细胞凋亡发生（见图3，封二）。

表1 Ad-p53治疗前后hIL-1β诱导的兔膝关节炎相关指标的变化

2.3 p53不能诱导滑膜成纤维细胞凋亡，但能抑制炎症因子产生

Ad-p53治疗hIL-1β诱导兔膝关节炎疗效显著，但TUNEL染色并未明确检测到细胞凋亡，而且组织学分析显示大量浸润的炎症细胞消失。我们用MTT法测定p53对滑膜细胞生长的影响，图4示：Ad-LacZ和Ad-p53分别以MOI=10和100去感染FLS，d3获取细胞，各组间细胞的生长情况无显著性差异。与对照组比较，无论MOI=10或100，Ad-p53组的FLS未见凋亡或死亡现象。进一步流式细胞仪检测发现：Ad-p53转染FLS后d3和d7，细胞生长周期停滞于G1期，均无凋亡峰，证实无凋亡发生。

将正常表达p53（野生型FLS）和过表达p53（Ad-p53转染的FLS）的滑膜细胞与IL-1β共同孵育24h，收集上清，检测IL-6的水平，结果显示野生型FLS产生的IL-6是p53过表达的FLS的5～10倍，提示p53显著抑制FLS产生IL-6。IL-6是RA等炎症性关节炎关节局部重要的致炎因子。

3 讨论

长期以来，突变p53引起的滑膜细胞凋亡异常被认为是RA的主要发病机制之一。Firestein等学者发现与肿瘤组织相似的p53基因突变，在RA软骨侵蚀处的滑膜和培养的RA滑膜细胞存在[6]。由于RA滑膜细胞p53基因发生显性负突变，导致其功能缺陷（Han等）。进一步研究显示，RA滑膜有标志DNA破坏的微卫星不稳定性存在，可能与DNA错配修复酶hMSH6的表达下降和hMSH6/hMSH3比例失衡有关，是导致p53等分子发生点突变的原因之一。动物实验证实，p53-/-小鼠发生Ⅱ型胶原诱导关节炎（CIA）的程度比野生型p53小鼠严重，提示p53与RA的发生和发展有关[7]。

我们的研究显示：p53治疗IL-1β诱导的兔膝关节炎效果显著，滑膜中大量浸润的炎症细胞消失，滑液的白细胞计数降低达10倍以上。但滑膜组织和滑膜细胞在p53的作用下并没有发生细胞凋亡，有趣的是，促炎症细胞因子IL-6被显著抑制。IL-6是一个调节炎症和免疫反应的多功能细胞因子，能促进T辅助细胞（Th）-17和B细胞的分化，在RA炎症的病理过程中作用重大。临床试验证实阻断IL-6可以有效治疗中重度RA，而且对病程久、MTX和TNF拮抗剂无效的难治性RA仍有显效，不仅降低RA疾病活动性、而且抑制骨破坏和改善患者的生活质量[8]。因此，推测p53很可能通过抑制IL-6等重要促炎症因子的产生发挥改善滑膜炎症的作用。

有学者研究急性肺损伤时发现：p53能减轻LPS诱导NF-κB在肺泡上皮细胞的活化，初步揭示了p53与炎性反应的关系[9]。转入Ad-P53重组体的RA动物模型，不仅滑膜炎明显改善，而且关节肿胀减轻、滑液中白细胞数目显著减少，甚至接近正常。FAS配体被称为死亡因子，利用腺病毒载体将其导入IL-1β诱导的兔关节炎模型，虽然滑膜组织大片脱落，滑膜炎症显著减轻，取得了极好的治疗效果，但关节软组织肿胀仍很明显，滑液中仍有大量的白细胞，数目较治疗前变化不大[2]。提示p53与FAS配体的作用机制不同，在短短的3d时间里，炎症细胞迅速减少，这一现象很难单纯用凋亡来解释。那么，p53是否通过不同的信号传导途径影响细胞因子和趋化因子的分泌导致炎症细胞的撤退或迁移？此假设有待进一步证明。

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