反义ATM多核苷酸对喉鳞状细胞癌ATM mRNA、蛋白影响的体外研究

李 丽，冯 俊，王朝莉，敬保迁△

(1.川北医学院病理教研室;2.川北医学院附属医院耳鼻喉科;3.川北医学院分子生物研究所，四川 南充 637007)

喉癌是头颈部原发于上皮的常见恶性肿瘤之一，目前主要治疗还是以手术和放射治疗为主，放疗可以充分保护喉的发声功能。ATM是与放射敏感性有关的基因，ATM蛋白表达水平差异与细胞放射敏感性程度之间存在一定的关系［1］。本研究中，我们使用反义多核苷酸作用于ATM以研究ATM mRNA、蛋白表达。

1 材料和方法

1.1 细胞系

人喉鳞状细胞癌细胞株(Hep-2)由四川大学华西医院上呼吸道实验研究中心惠赠。

1.2 试剂

Lipofectamine 2000、Opti-MEM I、Trizol kit购自美国Carlsbad公司;GAPDH单克隆抗体、SYBR Ex-Script RT-PCR Kit、SYBR Green Master Mix 试剂盒购自Takara公司;ATM单克隆抗体、BCIP/NBT购自美国Santa Cruz公司。

1.3 目标序列的选择及多核苷酸的合成

于NCBIGenBank查出人ATM序列，设计反义ATM核苷酸(AS:5'-GTACTAGACTCATGGTTCACAATTT-3');正义ATM核苷酸(Sen:5'-AAATTGTGAACCATGAGTCTAGTAC-3');错配 ATM核苷酸(Mis:5'-AAAATGTAAACCATAAGTCTAGAAC-3')。送上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.4 PCR 引物设计

将GAPDH作为内参对照，按照引物设计原则进行设计，交由上海生工生物工程技术服务有限公司合成(表1)。

表1 引物设计

1.5 多核苷酸转染喉鳞状细胞癌细胞

将生长良好的Hep-2约2×105，置于6孔板中培养，待其生长到70% ～80%时备用。取0.8 ug的反义ATM核苷酸、正义ATM核苷酸、错配ATM核苷酸及Lipofectamine 2000分别加入到Opti-MEM I中，在常温下作用5 min。而后将核苷酸与 Lipofectamine 2000在常温下作用20 min后加入Hep－2细胞中，在37°C，5%CO2孵箱中作用。6 h后用PBS洗两次。最后用RPMI-1640取代PBS，在37°C孵箱中过夜备用。

1.6 Western blot分析

收集1.5所述的细胞1×107，以冷 PBS清洗3次，以裂解缓冲液制备细胞总蛋白，总蛋白上样进行SDS-PAGE电泳，然后转膜(硝酸纤维素膜)，用5%的脱脂奶粉封闭硝酸纤维素膜上的蛋白潜在结合位点，加入ATM单克隆抗体(1∶100)4℃过夜，GAPDH作为阳性对照，加入二抗后BCIP/NBT试剂显色、照相。

1.7 real-time quantitative PCR 分析

收集1.5所述的细胞，按Trizol试剂盒说明书提取hep-2细胞总RNA，然后进RNA电泳，反转录合成cDNA，随后进行目的基因ATM和内标基因GAPDH Real Time PCR。扩增条件:95℃ 10 min;95℃ 15 s、60℃ 1 min，42个循环，每组及内标均设3个复孔。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 Western Blot检测转染AS-ODNs后hep-2细胞中ATM蛋白表达

将多核苷酸AS、Sen、Mis转染喉鳞状细胞癌细胞后，进行Western blot分析。从图1可以看出AS组蛋白表达明显较 Sen、Mis、hep-2、lipo(脂质体)组蛋白表达低，从图2(各组蛋白表达的灰度扫描)可以更准确的得出 AS、Sen、Mis、lipo与 hep-2组(对照组)的蛋白相对表达量以AS-lipo组最低，为(48.14±5.53)%。用SPSS 18.0软件分析各组蛋白表达灰度可以得出，AS组与 Sen、Mis、lipo、hep-2 组比较有统计学意义。Sen、Mis、lipo、hep-2组之间比较差异无统计学意义。

2.2 Real-time quantitative PCR检测转染ATM ASODNs后hep-2细胞中ATM mRNA的表达

将多核苷酸AS、Sen、Mis转染喉鳞状细胞癌细胞后，进行PCR分析，从图3可以看出AS组mRNA表达明显较 Sen、Mis、hep-2、lipo(脂质体)组 mRNA 表达低，AS、Sen、Mis、lipo与 hep-2 组(对照组)的 mRNA相对表达量以 AS-lipo组最低，为(11.03±2.51)%，用SPSS 18.0软件分析各组mRNA表达可以得出，AS 组与 Sen、Mis、lipo、hep-2 组比较差异有统计学意义。Sen、Mis、lipo、hep-2组之间比较差异无统计学意义。

3 讨论

参与DNA损伤修复磷酸化过程的蛋白包括ATM、P53等在乳腺癌、结肠癌、睾丸癌、肺癌、皮肤癌以及膀胱癌等的早期阶段就能检测得到［2－4］，这就暗示在肿瘤的早期阶段就会发生DNA损伤，甚至在许多肿瘤的野生型P53基因功能失活和基因组不稳定性改变之前就已出现。Raju［5］证实P53基因对原癌基因的过表达作出反应需要ATM激酶—一个对DNA双链断裂做出反应的主要调节剂。Mohammad A［6］推测在成人的急性淋巴细胞型白血病的诱导和缓解期，ATM缺乏能增加化疗药物对白血病治疗的敏感性。Jian等［7］通过反义多核苷酸作用于小鼠头颈鳞癌细胞株(SCCⅦ)ATM基因，从而增强了头颈鳞癌细胞对放射线的增敏性。江继平等［8］用ATM反义多核苷酸降低了喉癌细胞ATM蛋白的表达。因此，我们设计ATM反义多核苷酸从不同成面来验证反义ATM能否抑制喉鳞状细胞癌ATM的表达。

本研究显示，进行Western blot分析可以看出AS组蛋白表达明显较Sen、Mis、hep-2、lipo(脂质体)组蛋白表达低，为48.14% ±5.53%，AS组与 Sen、Mis、lipo、hep-2组比较差异有统计学意义。PCR分析可以看出AS、Sen、Mis、lipo与 hep-2组(对照组)的mRNA相对表达量以 AS-lipo组最低，为(11.03 ±2.51)%，AS 组与 Sen、Mis、lipo、hep-2 组比较差异有统计学意义。检测结果表明转染反义ATM组的ATM蛋白和ATM mRNA的表达明显低于转染正义ATM组、无关序列组及对照组，这就表明ATM表达的抑制是由于反义ATM多核苷酸序列介导的。因此，将反义ATM多核苷酸转染喉鳞状细胞癌可以抑制ATM mRNA和ATM蛋白的表达水平。已有研究［1］表明，ATM蛋白表达水平差异与细胞放射敏感性程度之间存在一定的关系 。江继平等［8］用脂质体将反义ATM导入头颈鳞癌细胞系(SCCⅦ)中，转染24 h后ATM蛋白表达量减少，与转入无关序列相比，转染反义ATM的SCCⅦ细胞在辐照后表现出内在放射敏感性增强。实验中我们用反义ATM使喉鳞状细胞癌细胞中ATM mRNA、蛋白的表达降低，故我们推测其亦有可能使喉鳞状细胞癌细胞对放射治疗的敏感性增强。

［1］Lei L，Michael S，Randy JL.Cellular responses to ionizing radiation damage［J］.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2001，49(4):1157 －1162

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［4］Bartkova J，Bakkenist CJ，Rajpert D，et al.ATM activation in normal human tissues andtesticular cancer［J］.Cell Cycle，2005，4(6):838－845

［5］Pusapati VR，Robert J.ATM promotes apoptosis and suppressestumorigenesis in response to Myc［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103(5):1446 －1451

［6］Haidar AM，Kantarjian H，Manshouri T，et al.ATM genedeletion in patients with adult acute lymphoblastic leukemia［J］.CANCER，2000，88(5):1057 －1062

［7］Zou J，Qiao XM，Ye HP，et al.Antisense inhibition of ATM gene enhances the radiosensitivity of head and neck squamous cell carcinoma in mice［J］.Journal of Experimental＆ Clinical Cancer Research，2008，27:56

［8］江继平，冯 俊，唐嗣泉，等.反义ATM在体外对喉鳞状细胞癌ATM蛋白表达影响的研究［J］.川北医学院学报，2011，26(5):394－396