广西地区原发性肝细胞癌患者甲胎蛋白基因多态性检测及其临床意义分析

莫国辉，黄健旅，梁 毓，黎殿德，于 龙，刘征涛，齐鲁楠，覃 晓，彭民浩，肖开银，李佳荃，吴华，彭 涛△

(1.广西医科大学第一附属医院肝胆血管外科;2.广西医科大学科学实验中心，广西 南宁 530021)

检测甲胎蛋白(alpha fetal protein，AFP)是目前我国最常用的肝癌血清肿瘤标志物之一［1］。但是随着研究的深入，人们发现在采取不同的诊断阈值时，AFP对诊断HCC的特异性高，而敏感性不足。因此，AFP对肝癌的诊断准确度一直不能令人满意［2－3］。本课题组前期进行了影响广西健康人群的血清肿瘤学标志物水平的全基因组定量性状连锁分析关联研究，获得与AFP水平相关并达到全基因组统计学显著水平的单核基因多态性位点(single nucleotide polymorphisms，SNPs)三 个 (候 选 基 因rs12506899、rs16849384位于 AFP基因;候选基因rs7688274位于白蛋白基因)。我们在本研究中探讨前期获得的影响健康人群血清AFP水平的候选基因型是否与原发性肝细胞癌人群中的血清AFP水平以其临床病理参数存在关联性。

1 材料与方法

1.1 研究对象

本实验选取2005年3月至2011年10月在广西医科大学一附院及广西壮族自治区肿瘤医院诊断为原发性肝细胞癌患者177例(本实验所取标本均经患者同意及医院医学伦理委员会批准)。其中男性165例，女性12例。年龄范围为27～78岁，中位年龄为46岁。术前获得患者的血清AFP水平及相关临床资料。所有患者术后均进行随访追踪，随访时间为2005年3月至2012年3月，中位随访时长为17个月。排除标准:术后病理为胆管细胞癌及混合细胞型肝癌者;复发肝癌、肝转移癌及术前行经肝动脉治疗者(包括TAI，TAE，TACE);肿瘤直径大于5 cm者。

1.2 主要试剂及探针

组织DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，FastStart Universal Probe Master(Rox)购自美国罗氏公司。探针和引物是根据在NCBI SNP公开发表SNP位点信息，定购由美国ABI公司的Assay－by－DesignTM－service设计的全套探针和引物，探针分别用FAM和VIC标记(表1)。

表1 探针信息

1.3 组织DNA提取

组织DNA提取按天根公司试剂盒操作说明书进行。用Thermo公司生产的NANODROP2000超微量分光光度计测定DNA溶液在260 nm和280 nm处的吸光度及其比值(OD值)与DNA浓度。A260 nm/A280 nm 为 1.7～1.9，此值说明:DNA 纯度符合PCR的要求。并调整DNA浓度至20 ng/μL，分装保存。

1.4 基因型检测

基因型检测采用美国ABI公司生产的StepOne-Plus Real-Time PCR System分析平台。每个PCR反应体系总体积为 25 μL，包含 FastStart Universal Probe Master(Rox)12.5 μL，SNP Genotyping Assay 0.625 μL，20 ng/μL 基因组 DNA 1 μL，DNase/RNase-Free ddH2O 10.875 μL。 基 因 型 检 测 按StepOnePlus Real-Time PCR System操作说明书进行。

2 结果

2.1 基因分型结果

位点rs12506899在全部177例样本中，测出纯合子T/T 80例，纯合子G/G 29例，杂合子G/T 49例，未测出19例。位点rs16849384在全部177例样本中，测出纯合子C/C 41例，纯合子T/T 54例，杂合子C/T 54例，未测出28例。位点rs7688274在全部177例样本中，测出纯合子A/A 78例，纯合子G/G 27例，杂合子C/T 35例，未测出37例(图1、图2、图3)。

2.2 统计量计算及生存分析结果

经成组设计秩和检验(Kruskal-Wallis法)，三候选位点各基因型分布频率差异无统计学意义。在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)患者中，同时合并肝硬化的患者与无肝硬化的患者术前AFP水平差异有统计学意义(P=0.047)。其中，在有乙肝背景的HCC患者中，无肝硬化与肝硬化组的AFP水平差异有统计学意义(P=0.017)。其中无肝硬化组的AFP水平高于肝硬化组。而在无乙肝背景的HCC患者中，无肝硬化组与肝硬化组的AFP水平差异无统计学意义(表2、表3)。

生存分析结果提示不同P53抗体水平对患者无瘤生存时间有影响(P=0.010)。其中P53抗体阳性程度越高者无瘤生存时间越短，见图4。

表2 肝硬化与AFP水平的相关分析

表3 肝硬化与乙肝不同暴露情况对AFP水平的影响

3 讨论

AFP的病理性升高可见于肝细胞的再生和恶性肿瘤。研究报道肝癌患者的AFP水平比健康人群增加高达195倍［4］，但是临床仍有约30%的AFP阴性HCC患者成为应用AFP筛查和诊断HCC的盲区［5］。本研究中，影响广西正常人群AFP水平的候选基因型对HCC患者AFP水平的影响无统计学意义，提示可能在正常人群中影响AFP水平的遗传机制有别于HCC人群或者在HCC人群中贡献度不大，也不能解释临床上约30%的HCC患者AFP阴性的原因。

本研究发现:在有乙肝背景的HCC患者中，无肝硬化组与肝硬化组的AFP水平差异有统计学意义，其中无肝硬化组的AFP水平高于肝硬化组。而在无乙肝背景的HCC患者中，无肝硬化组与肝硬化组的AFP水平差异无统计学意义。进一步对患者血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平进行分析，见表4、表 5。

表4 有无肝硬化分组间ALT水平的比较

表5 肝硬化与乙肝不同暴露情况分组间ALT水平的比较

结果显示，无肝硬化组和肝硬化组患者的ALT水平差异有显著性，其中在有乙肝背景的患者中无肝硬化组的ALT水平要显著高于肝硬化组。这说明无肝硬化组患者可能存在活动性肝炎等肝功能受损情况，导致肝细胞的再生水平高于无肝硬化组，AFP水平亦显著高于无肝硬化组。

国内有研究［6］表明:慢乙肝、饮酒、年龄及肝功能(包括ALT，AST，总胆红素和直接胆红素)均可导致AFP水平异常(＞20 ng/mL)。肝炎患者肝细胞再生活跃，血清中AFP含量则明显升高，其机制是肝细胞受感染后的急性反应，提示肝细胞的再生过程，是新生肝细胞幼稚化现象［7］。本研究中所得结果与上述文献报道是一致的。

目前已经明确P53基因丢失或突变，可诱发多种癌变［8］。通常认为，P53抗体阳性提示肿瘤恶性生物学行为［9］。高志勇等［10］研究发现，正常人、慢性乙型肝炎患者、乙型肝炎肝硬化患者和肝细胞癌患者血清中 P53抗体阳性率分别为 0.65%(3/465)、2.46%(6/244)、5.47%(7/128)和 10.26%(12/117)，有逐渐升高的趋势。本实验结果提示P53抗体阳性水平与HCC患者预后相关，且P53抗体阳性程度越高者预后越差。这与国内外相关报道一致。

总之，本实验通过尝试在HCC患者中验证候选基因与HCC患者的AFP水平是否存在相关性，探索AFP在HCC的诊断、治疗及预后监测中的具体调节机制。实验结果提示候选位点基因型并不影响HCC患者的AFP水平及预后。结合目前相关研究表明:现阶段基因型检测并不能代替AFP作为HCC早期诊断和筛查的手段。

［1］Yang L，Parkin D M.Estimates of cancer incidence in China for 2000 and projections for 2005 ［J］.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2005，14:243 －250

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［4］田耀洲.血清甲胎蛋白水平对肝硬化肝癌诊断价值的评价［J］.中国煤炭工业医学杂志，2005，(1):17 －19

［5］中华人民共和国卫生部.原发性肝癌诊疗规范(2011版)［Z］.北京:中华人民共和国卫生部(卫办医政发［2011］121号)，2011

［6］陆海英.甲胎蛋白检测在HBV感染相关疾病中的临床意义［J］.中国临床药理学与治疗学，2007，12(8):939 －942

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［9］Saffroy R.Clinical significance of circulating anti-P53 antibodies in European patients with hepatocellular carcinoma［J］.Br J Cancer，1999，79:604 －610

［10］高志勇.肝细胞癌患者血清中P53抗体检测［J］.中国医学检验杂志，2005，6(4):256 －257