美洲大蠊i型溶菌酶基因的克隆及其功能预测

王 赟，龙高群，张春林＊，田 茂

（1.贵阳医学院医学生物技术教研室，贵州 贵阳 550004；2.贵阳医学院生物学教研室，贵州 贵阳 550004）

溶菌酶（EC3.2.1.17），又称 N－乙酰胞壁质聚糖水解酶，它能切断肽聚糖中的N－乙酰葡萄糖胺和N－乙酰胞壁酸之间的β－1，4糖苷键之间的联结，破坏肽聚糖支架，在内部渗透压的作用下使细胞胀裂开，引起细菌裂解[1]。因此，它是一种广谱的抗菌效应分子。除此之外，它还可诱导调节其他免疫因子的合成和分泌[2－3]。

在动物中有3种不同类型的溶菌酶，即c型溶菌酶（chicken－lysozyme type）、g 型溶菌酶（goosetype）和i型溶菌酶（invertebrate－type）[4－5]。其中，c型溶菌酶是同时存在于无脊椎动物和脊椎动物中的类型，g型溶菌酶主要存在于脊椎动物，而i型溶菌酶存在于无脊椎动物中。近年来对i型溶菌酶的研究多见于海洋生物，如文蛤[6]、斑节对虾[7]等，但对昆虫i型溶菌酶的研究较为少见。昆虫具有许多免疫功能的多肽类物质，与血细胞一起组成了昆虫体内免疫功能体系。受到细菌等异物刺激后，很多昆虫均能有效诱导溶菌酶、抗菌肽、凝集素和血素等血淋巴抗菌蛋白的增加，从而增强机体的免疫防卫机能，维持内环境的稳定[8]。

美洲大蠊属于昆虫纲蜚蠊目，是南方地区室内优势品种，它能携带许多病原微生物如痢疾杆菌、副伤寒沙门菌、绿脓杆菌和寄生虫等，是家畜及人类许多传染性疾病的重要传播媒介。因而它可能具有独特的免疫防御机制，比一般生物更能有效抵御病原微生物的感染。有研究报道，发现美洲大蠊在大肠埃希菌诱导后，其血淋巴的抗菌活性增强，考虑经诱导后其溶菌酶、抗菌肽、凝集素和血素等血淋巴的抗菌蛋白增加[9]。本研究通过RT－PCR技术和RACE PCR技术获得了美洲大蠊i型溶菌酶全长编码区，并预测了其可能具有的功能，为今后对该基因功能及分子进化的研究提供了重要的基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

实验动物为美洲大蠊（Periplaneta americana），由贵阳医学院生物学教研室饲养繁殖。

1.2 方法

1.2.1 美洲大蠊i型溶菌酶基因片段的获取 以冈比亚按蚊i型溶菌酶氨基酸序列（XP－309527）为探针，对美洲大蠊EST序列库进行tBLASTn检索，仅得到1条与之同源的序列。将此序列用ORF Finder查找开放阅读框，并进行BLAST比对，为潜在i型溶菌酶编码基因，但其编码区5'端不完整。

1.2.2 利用RT－PCR获得美洲大蠊i型溶菌酶基因片段 采用Trizol法提取新鲜美洲大蠊组织样本总RNA，用紫外分光计测定总RNA纯度和浓度，cDNA第一链的合成按照Fermentas第一链合成试剂盒操作说明进行。根据比对获得的美洲大蠊潜在i型溶菌酶基因片段设计引物，上游引物5'－CAAAGTCTCTGGTTCTGGTG－3'，下游引物5'－ACACTAGACAGCAGAGGAG－3'，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应体系为25μL：10×buffer缓冲液 2.5μL，MgCl2（25 mmol／L）2.5μL，dNTPs Mixture（10nmol／L）2.0 μL，mtP1引物（10mmol／L）2.0μL，mtP2引物（10 mmol／L）2.0μL，模板 DNA（50ng／μL）2.0μL，Taq酶（5U／μL）0.2μL，双蒸水补足至25μL。扩增条件为：94℃预变性5min；94℃1min，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃延伸5min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段，并与pMD－18T载体进行连接、转化大肠埃希菌DH5α；蓝白斑筛选阳性克隆并经菌落PCR验证后，送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，从而得到美洲大蠊i型溶菌酶部分cDNA序列。

1.2.3 利用5'－RACE PCR扩增已知cDNA片段5'末端 根据测序获得的cDNA部分序列，设计5'－RACE PCR引物Lysozyme 5'GSP：5'－GCAGCCTGCACTTGTCGCTGACATT－3'和 Lysozyme 5'Nest：5'－AGCCACCTAGGCGATGGATGGCTGCAT－3'。本试验根据GeneRacerTM Kit试剂盒说明，扩增出已知cDNA片段的5'末端并进行测序。

1.2.4 用生物信息学方法对美洲大蠊i型溶菌酶基因序列进行分析 将RT－PCR和5'－RACE PCR测序结果用DNAMAN软件进行序列拼接，并用ORF Finder预测美洲大蠊i型溶菌酶的开放阅读框，推导出氨基酸序列。用NCBI Blast对该序列进行同源比对。用ProtParam分析该蛋白等电点、分子质量和分子式；ProtScale分析蛋白质的疏水性；Singal P进行信号肽预测；TMHMM对跨膜区进行分析；ExPASY的TargetP对该蛋白进行亚细胞定位；DNA Star软件预测蛋白质的二级结构；SWISSMODEL进行同源建模[10]。利用Clustal W对美洲大蠊和其他物种的i型溶菌酶进行同源比对，并用Mega软件构建c型溶菌酶、i型溶菌酶和g型溶菌酶的分子系统树，预测进化关系。

图1 美洲大蠊i型溶菌酶RT－PCR结果Fig.1 RT－PCR result of i－type lysozyme from Periplaneta americana

2 结果

2.1 美洲大蠊i型溶菌酶基因的获得

以冈比亚按蚊i型溶菌酶为探针，比对获得美洲大蠊潜在编码i型溶菌酶的EST序列，针对此序列设计引物经RT－PCR扩增，获得511bp的片段（图1）。将此序列在NCBI进行比对，发现其仅具备i型溶菌酶部分保守结构域，编码区具备终止密码子，无起始密码子。因此，针对此序列设计5'－RACE引物，经PCR扩增获得445bp的片段（图2）。将两端序列进行拼接，得到了总长为525bp的溶菌酶基因片段。将此序列登录GenBank，登录号为JQ754173。

2.2 美洲大蠊i型溶菌酶的生物信息学分析

2.2.1 美洲大蠊i型溶菌酶序列特征 在获得的美洲大蠊i型溶菌酶525bp片段中，包括5'非编码区12bp和3'非编码区18bp。其完整的开放阅读框长495bp，编码164个氨基酸（图3）。经ProtParam分析，该蛋白的等电点为5.69，分子质量计算值为17.6ku，分子式为C769H1192N210O234S16。

2.2.2 美洲大蠊i型溶菌酶信号肽预测 将推导的美洲大蠊i型溶菌酶氨基酸序列在丹麦技术大学生物序列分析中心（CBS）的网站ht tp：／／www.cbs.dt u.dk／services／SignalP／上进行在线分析，结果显示，其N端具有27个氨基酸的信号肽MATACKSLVLVAAAAIACSLFGSFTLG，从而可以判定其为胞外表达的效应分子，成熟肽包含136个氨基酸（图4）。

图2 美洲大蠊i型溶菌酶5'－RACE PCR结果Fig.25 '－RACE PCR result of i－type lysozyme from Periplaneta americana

图3 美洲大蠊i型溶菌酶核苷酸及推导的氨基酸序列Fig.3 Nucleotide and deduced amino acid sequences of i－type lysozyme fromPeriplaneta americana

图4 美洲大蠊i型溶菌酶信号肽分析结果Fig.4 The prediction of signal peptide of i－type lysozyme fromPeriplaneta americana

2.2.3 美洲大蠊i型溶菌酶亲水性与疏水性分析通过 ProtScal（http：／／web.expasy.org／cgi－bin／protscale／protscale）分析该蛋白的亲水性和疏水性，结果显示该蛋白在1～20氨基酸处有一明显的疏水性区域（图5），其中第16位的异亮氨酸疏水性最强（分值为4.500），而第92位精氨酸亲水性最强（分值为－4.500）。

2.2.4 美洲大蠊i型溶菌酶跨膜区分析 TMHMM （http：／／www.cbs.dtu.dk／services／TMHMM／）预测美洲大蠊i型溶菌酶在第7～26位氨基酸区域有一明显的跨膜区（图6）。

2.2.5 美洲大蠊i型溶菌酶的亚细胞定位 通过在线软件PSORT（http：／／psort.hgc.jp／form2.html）分析美洲大蠊i型溶菌酶的亚细胞定位，预测结果显示，该蛋白主要分泌到细胞外（55.6%），其余存在于细胞质、液泡、内质网和线粒体中（各占11.1%）。

2.3 美洲大蠊i型溶菌酶结构分析

2.3.1 美洲大蠊i型溶菌酶二级结构分析 利用DNA Star软件对美洲大蠊i型溶菌酶的二级结构进行预测（图7），结果显示按Chou－Fosman预测法，该蛋白α－螺旋、β－折叠和β－转角较均匀地分布于整个氨基酸链。

2.3.2 美洲大蠊i型溶菌酶三级结构的分析 将美洲大蠊i型溶菌酶的氨基酸序列进行蛋白质保守结构域数据库搜索（Conserved Domain Database，CDD），结果发现，它具有失稳酶家族（Destabilase superfamily）的保守结构域。利用SWISS－MODEL同源建模，得到美洲大蠊i型溶菌酶氨基酸序列的预测三级结构，与已知的i型溶菌酶的三级结构模型相似性很高。

图5 美洲大蠊i型溶菌酶疏水性分析结果Fig.5 Hydrophobicity analysis of i－type lysozyme from Periplaneta americana

图6 美洲大蠊i型溶菌酶跨膜区分析结果Fig.6 Transmembrane domain analysis of i－type lysozyme fromPeriplaneta americana

2.4 美洲大蠊i型溶菌酶同源性比较和分子进化分析

美洲大蠊i型溶菌酶氨基酸序列经Blast分析显示，它与黑腹果蝇、冈比亚按蚊i型溶菌酶有较高的相似性（分别为64%和53%）（图8）。将该序列与线形动物门的秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，登录号NP－500207），环节动物门的医蛭（Hirudo medicinalis，登录号 AAA96144）和安德爱胜蚓（Eisenia andrei，登录号 ABC68610），软体动物门的菲律宾蛤仔（Venerupis philippinarum，登录号BAB33389）、美洲牡蛎（Crassostrea virginica，登录号P83673），节肢动物门的冈比亚按蚊（A－nopheles gambiae，登录号AAT51799、ABP35929）、黑腹果蝇（Drosophila melanogaster，登录号ACD99447）、意大利蜜蜂（Apis mellifera，登录号XP＿393161）、地熊蜂（Bombus terrestris，登录号 XP＿003394100）和棘皮动物门的刺参（Apostichopus japonicus，登录号ABK34500）、红海盘车（Asterias rubens，登录号AAR29291）的i型溶菌酶成熟肽进行Clustal W比对（图8），可以看出所有物种的i型溶菌酶均具有异构肽活性位点H。除节肢动物门的动物外，线性动物门、环节动物门和棘皮动物门的动物都具有糖苷酶活性位点E／D／S；同时，这些门类动物的i型溶菌酶具有一段特有的保守序列MDVGSLSCG（P／Y）（Y／F）QIK。

图7 美洲大蠊i型溶菌酶二级结构分析结果Fig.7 Secondary structure analysis of i－type lysozyme fromPeriplaneta americana

图8 美洲大蠊i型溶菌酶与其他物种i型溶菌酶多序列比对结果Fig.8 Multiple alignments of Periplaneta americanai－type lysozyme with other known i－type lysozyme deduced amino acid sequences

根据美洲大蠊i型溶菌酶氨基酸序列与其他动物的c型、g型和i型溶菌酶构建的系统发育树（表1和图9）结果显示，3种不同类型的溶菌酶分成3个大的分支，其中i型溶菌酶又根据有无糖苷酶活性位点划分为两个分支，美洲大蠊i型溶菌酶属于无糖苷酶活性位点分支。

表1 多序列比对及构建系统发育树所用的序列Table1 Sequences used for multiple alignment and phylogenetic analysis

图9 基于i型、c型和g型溶菌酶氨基酸序列构建的系统发育树Fig.9 Phylogenetic analysis of the protein sequences of various i，c，and g type lysozymes

3 讨论

本试验以美洲大蠊为研究对象，通过RT－PCR和RACE PCR技术首次克隆得到其i型溶菌酶完整编码区序列（登录号：JQ754173），并对其氨基酸序列进行了基本生物信息学分析。通过同源比对，该序列与黑腹果蝇和冈比亚按蚊i型溶菌酶具有同源性。系统发育树分析表明，美洲大蠊i型溶菌酶与同属节肢动物门的冈比亚按蚊、黑腹果蝇、蜜蜂、熊蜂i型溶菌酶同聚于i型溶菌酶这一分支，而且，系统发育树的结果认同了c、i溶菌酶起源于同一祖先g型溶菌酶这一说法[5]。

通过蛋白质保守结构域分析，它具有失稳酶家族（Destabilase superfamily）的保守结构域，而且它和失稳酶的三级结构模型也极其相似。失稳酶（destabilase）最初发现存在于欧洲医蛭，研究表明其具有异构肽活性，能水解纤维蛋白的ε－（γ－Glu）－Lys的交联键，从而使纤维蛋白发生水解[11]。后来，人们在失稳酶中也发现了糖苷酶活力，于是失稳酶被认为是一种新的溶菌酶，进一步被认定为i型溶菌酶[12－13]。由于失稳酶既具有失稳酶活性，又具有糖苷酶活性，故称作DL（destabilase－lysozyme）。美洲大蠊i型溶菌酶具有失稳酶的保守结构域，三级结构与失稳酶的三级结构相似，而且本文在对不同物种i型溶菌酶的同源比对中发现，所有物种均具有H位点，此位点被认为是异构肽活性的功能位点[14]。同时，同源比对中的安德爱胜蚓（Eisenia andrei）i型溶菌酶（登录号：ABC68610），它也具有 H位点，而且有学者对安德爱胜蚓i型溶菌酶的功能进行研究，发现它具有异构肽的活性，能够切断p－NA中的L－γ－Glu－Pna[15]，因而我们推测，美洲大蠊溶菌酶同样具有异构肽活性，能够水解纤维蛋白。

结构决定功能，溶菌酶的抑菌功能依赖于糖苷酶活力，由其自身结构决定。c型溶菌酶有2个活性位点E、D[16]，g型溶菌酶有3个活性位点，即E和2个D[17]，而i型溶菌酶为E、D、S[16]。对安德爱胜蚓和海刺参的i型溶菌酶研究发现，它们具有活性位点E、D、S，功能研究也证实其具有抑菌活性[15，18]。而对不具有此活性位点的冈比亚按蚊i型溶菌酶进行研究发现，经细菌诱导后的real－time定量结果并未提示其表达量的增加，但在血餐后i型溶菌酶的表达量上调，因而作者认为i型溶菌酶可能在冈比亚按蚊消化道发挥了消化细菌的作用，也有可能是它发挥了异构肽活性，水解纤维蛋白从而达到破坏血凝块的目的，但作者并未进行体外实验研究i型溶菌酶是否具有抑菌功能[19]。有趣的是，对节肢动物门的斑节对虾i型溶菌酶研究发现，它并不具备糖苷酶活性位点E、D、S，但其重组蛋白对革兰氏阴性菌有明显的抑菌作用[7]。本研究中的美洲大蠊i型溶菌酶并不具备糖苷酶活性位点，它是否具有抑菌活性，需要下一步的实验才能证实。但有学者提出，或许这些功能位点并不是i型溶菌酶抑菌活性必须具备的，可能不具备这些位点它同样具有抑菌活性[20]。

综上所述，我们对美洲大蠊i型溶菌酶的基本特征进行分析，并预测了其可能具备的功能。美洲大蠊i型溶菌酶具有活性位点H，推测其应该具备异构肽活性，能水解纤维蛋白。但它不具备抑菌活性必须的位点E、D、S，其是否具备抑菌活性，能在美洲大蠊独特的免疫机制中发挥重要的作用，还需要进一步的试验来证实。

[1]李 鹤，马 力，王维香.溶菌酶的研究现状[J].食品研究与开发，2008，29（1）：182－185.

[2]Sonomi M，Junichi H ，Ikuo H ，et al.Expression of Japanese flounder c2type lysozyme cDNA in insect cells[J].Dev Comp Immunol，2001，25（5）：439－445.

[3]Chipman D M，Sharon N.Mechanism of lyozyme action[J].Science，1969，165（892）：454－465.

[4]Prager E M，Jollès P.Lysozymes：Model enzymes in biochemistry and molecular biology[M].Berlin：Birkhāuser，1996：9－31.

[5]Bachali S，Jager M，Hassanin A，et al.Phylogenetic analysis of invertebrate lysozymes and the evolution of lysozyme function[J].J Mol Evo，2002，54（5）：652－664.

[6]Yue X，Liu B Z，Xue Q G.An i－type lysozyme from the Asiatic hard clam Meretrix meretrix potentially functionging in host immunity[J].Fish ＆Shellfish Immunol，2011，30（2）：550－558.

[7]Supungul P，Rimphanitchayakit V，Aoki T，et al.Molecular characterization and expression analysis of a c－type and two novel muramidase－deficient i－type lysozymes from Penaeus monodon[J]，Fish ＆Shellfish Immunol，2010，28（3）：490－498.

[8]王荫长.昆虫生物化学，[M].北京：中国农业出版社，2004：245－270.

[9]金小宝，王 艳，朱家勇.诱导前后美洲大蠊血淋巴抗菌活性的研究[J].广东药学院学报，2006，22（6）：665－682.

[10]Arnold K，Bordoli L，Kopp J，et al.The SWISS－MODEL Workspace：A web－based environment for protein structure homology modeling[J].Bioinformatics，2006，22（2）：195－201.

[11]Zavalova L，Lukyanov S，Baskova I，et al.Genes from the medicinal leech（Hirudo medicinalis）coding for unusual enzymes that specifically cleave endo－ε－（γ－Glu）－Lys isopeptide bonds and help to dissolve blood clots[J].Mol Gen Genet，1996，253（1－2）：20－25.

[12]Zavalova L，Baskova I P，Lukyanov S A，et al.Destabilase from the medicinal leech is a reprssentative of a novel family of lysozymes[J].Biochimi Biophysica Acta，2000，1478（1）：69－77.

[13]Zavalova L L，Baskova I P，Barsova E V，et al.Recombinant destabilase－lysozyme：synthesis de novo in E.coli and action mechanismof the enzyme expressed in Spodoptera f rugiperda[J].Biochemistry（Moscow），2004，69（7）：776－781.

[14]Yue X，Liu B Z，Xue Q G.An i－type lysozyme from the Asiatic hard clam Meretrix meretrix potentially functioning in host immunity[J].Fish ＆Shellfish Immunol，2011，30（2）：550－558.

[15]JoskováR，ŠilerováM，ProcházkováP，et al.Martin bilej.Identification and cloning of an invertetrate－type lysozyme from Eisenia Andrei[J].Dev ＆Com Immuno，2009，33（8）：932－938.

[16]Cheetham J C，Artymiuk P J，Phillips D C.Refinement of an enzyme complex with inhibitor bound at partial occupancy[J].J Mol Biol，1992，224（3）：613－628.

[17]Kawamura S，Ohno K，Ohkuma M，et al.Experimental verifica tion of the crucial roles of Glu73in the catalytic activity and structural stability of goose type lysozyme[J].J Biochem，2006，140（1）：75－85.

[18]Cong L，Yang X J，Wang X X，et al.Characterization of an itype lysozyme gene from the sea ccumber stichopus japonicus，and enzymatic and nonenzymatic antimicrobial activities of its recombinant protein[J].J Biosci Bioeng，2009，107（6）：583－588.

[19]Paskewitz S M，Li B，Kajia M K.Cloning and molecular characterization of two invertebrate－type lysozymes from A－nopheles gambiae[J].Ins Mol Bio，2008，17（3）：217－225.

[20]Callewaert L，Michiels C W.Lysozymes in the animal kingdom[J].J Biosci，2010，35（1）：127－160.