成年珍禽禽流感免疫抗体消长规律及免疫程序的研究

邓家波，杨晓梅，王 强，李兴玉，余建秋，廖党金，牛李丽，林 毅，严慧娟，谢 晶

（1.成都动物园 成都市野生动物研究所，四川 成都 610081；2.四川省畜牧科学研究院，四川 成都 610066）

禽流感（Avian influenza，AI）是由正黏病毒科A型流感病毒引起的禽类一种严重传染病，也是第1个实行全球性监测的传染病，被世界动物卫生组织（OIE）列为必须报告的传染病。高致病性禽流感可引起禽类大批发病死亡[1－2]，同时也会感染野生鸟类和人类[3－6]。目前流行于中国大陆的禽流感病毒主要血清型是H5亚型和H9亚型，H5亚型禽流感病毒是主要的高致病性毒株，可引起禽类大批急性发病死亡[7]；H9亚型禽流感病毒多为低致病性毒株，主要引起产蛋下降或呼吸道症状[8]。近年来，禽流感在野生鸟类、动物园珍禽中也有暴发的情况[9－11]，不仅对珍稀野禽的繁育保护带来巨大的挑战，还对人的健康造成很大的威胁[12]。因此，采取有效的预防措施加强对野禽类的保护，不仅可以防止疫情的暴发，还可以保证人类的公共卫生安全。目前最有效的措施就是免疫接种，而我国没有专门用于珍禽的禽流感疫苗，珍禽禽流感的防控只能使用家禽禽流感疫苗[13－15]。而关于此类疫苗用于珍禽的免疫安全性及免疫效果的研究报道在国内外都比较少。本研究拟对家禽用禽流感（H5＋H9）二价灭活疫苗免疫接种动物园成年珍禽后的血清抗体消长规律进行研究，并结合动物园的实际建立一个合理的免疫程序。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗 禽流感（H5＋H9）二价灭活疫苗，批号：2009008，哈尔滨维科生物技术开发公司生产。

1.1.2 试验用动物 成都动物园圈养的8种珍禽，包括孔雀6只，原鸡6只，雉鸡4只，白冠长尾雉6只，东方白鹳2只，斑头雁4只，赤麻鸭2只，鸳鸯2只。

1.1.3 试剂 H5亚型禽流感抗原、阳性血清（批号分别为200901、200801）；H9亚型禽流感抗原、阳性血清（批号分别为07102101、080305），均购自哈尔滨维科生物技术开发公司。

1.1.4 10mL／L红细胞悬液 采集3只未免疫禽流感疫苗的健康公鸡血液与等体积阿氏液混合，用pH 7.2的0.01mo1／L PBS液离心洗涤3次，洗涤后用PBS配成体积分数为10mL／L红细胞悬液，4℃保存备用。

1.2 方法

1.2.1 免疫接种 用禽流感疫苗免疫接种成都动物园圈养的8种珍禽，每种珍禽随机分为2组，分别于胸肌肌肉注射0.5mL／羽和1.0mL／羽，所有免疫接种珍禽都套上脚标，做好编号。

1.2.2 血清采集 对孔雀、东方白鹳等珍禽分别在免疫接种前、免疫接种后14、21、35、90、150、222、280、340、400d（论文的表中分别用 B、A14、A21、A35、A90、A150、A222、A280、A340、A400表示免疫接种前及免疫接种后的各时间段）翅下静脉采集试验血液；对白冠长尾雉、赤麻鸭等珍禽分别在免疫接种前、免疫接种后14、21、35、90、126d（加强免疫时间）、二免后14、24、98、155、210d（文的表中分别用B、A14、A21、A35、A90、A126、As14、As24、As98、As155、As210表示免疫接种前、免疫接种后及二免后的各时间段）翅下静脉采集血液，待血清析出后，8000r／min离心4min，吸出血清，同时在离心管壁标注脚标号，置－20℃冰箱保存备用。

1.2.3 抗体检测 按《高致病性禽流感诊断技术》（GB／T 18936－2003）所规定的方法，分别用 H5亚型和H9亚型禽流感病毒HI标准抗原，进行免疫抗体水平检测。

1.2.4 结果判定 以完全抑制4个血凝单位抗原的血清最高稀释倍数作为HI效价，只有阴性对照孔效价不大于2log2，阳性对照孔效价误差不超过1个log2时，试验结果才有效。按照农业部相关标准，禽流感HI效价≥4log2判为免疫合格。

1.2.5 数据处理 应用EXCEL和SPSS16.0统计软件对试验数据进行分析比较。

2 结果

2.1 根据试验数据统计结果

根据各种珍禽疫苗后的免疫应答效果，即产生禽流感H5、H9亚型抗体的水平高低，将结果分为两个种群，其中孔雀、原鸡、东方白鹳、斑头雁免疫应答结果较好，即抗体水平较高，而白冠长尾雉、雉鸡、赤麻鸭、鸳鸯、免疫效果则相对较差。

2.1.1 孔雀、东方白鹳等免疫应答好的珍禽血清禽流感病毒抗体效价检测 对动物园圈养的孔雀、原鸡、东方白鹳、斑头雁4种野生珍禽，按0.5mL／羽和1.0mL／羽分成两组分别免疫接种注射禽流感H5N1－H9N2二价灭活苗，免疫效果良好。这4种珍禽群体H5、H9亚型禽流感病毒抗体值消长规律及免疫合格率分别见表1、表2。

表1 孔雀等4种珍禽H5亚型禽流感病毒抗体值消长规律及免疫接种合格率Table1 Immune antibody dynamics and antibody qualification rate of avian influenza virus H5antibody in 4species of rare birds

孔雀、原鸡H5亚型禽流感病毒抗体水平免疫接种前都低于4log2，斑头雁H5亚型抗体水平免疫接种前虽然高于4log2，但免疫合格率只有50%，免疫接种后14d开始 ，4种珍禽的抗体水平均很快上升，21d抗体水平达高峰，以后抗体水平开始下降。免疫应答好的珍禽孔雀、东方白鹳、斑头雁H5亚型抗体在免疫接种后400d仍能维持较高效价的抗体水平，免疫合格率仍为100%，原鸡在400d时也有较高的抗体水平，但280d时免疫合格率低于70%。

孔雀H9亚型禽流感病毒抗体水平免疫接种前均低于4log2，免疫接种后14d，4种珍禽抗体水平快速升高，21d以后抗体水平缓慢下降。孔雀在免疫接种后400d时，还能维持在5log2以上较高抗体水平，免疫合格率为83.33%，而原鸡、东方白鹳、斑头雁3种珍禽在免疫接种后400d时，抗体水平还维持在5log2以上水平，免疫合格率仍为100%。

2.1.2 白冠长尾雉、赤麻鸭等珍禽禽流感血清抗体效价检测 圈养的白冠长尾雉、雉鸡、赤麻鸭、鸳鸯4种珍禽，按0.5mL／羽和1.0mL／羽分成两组免疫注射禽流感H5N1－H9N2二价灭活苗，抗体水平较低。这4种珍禽群体禽流感H5、H9亚型抗体消长规律及免疫合格率分别见表3、表4。

表2 孔雀等4种珍禽H9亚型禽流感病毒抗体值消长规律及免疫合格率Table2 Immune antibody dynamics and antibody qualification rate of avian influenza virus H9antibody in 4species rare birds

表3 白冠长尾雉等珍禽H5亚型禽流感病毒抗体消长规律及免疫合格率Table3 Immune antibody dynamics and antibody qualification rate of avian influenza virus H5antibody in 4species rare birds

白冠长尾雉等4种珍禽H5、H9亚型禽流感病毒抗体水平在免疫接种前都很低，白冠长尾雉、雉鸡、赤麻鸭H5亚型禽流感病毒抗体在首次免疫接种21d后升高，此后开始降低，90d时抗体水平已经很低，而鸳鸯首次免疫接种后几乎没有产生抗体。二次加强免疫接种后，白冠长尾雉、雉鸡、赤麻鸭、鸳鸯4种珍禽在14d时抗体水平开始升高，在210d时，多数能保持较高的抗体水平，且有较高的免疫合格率。H9亚型禽流感病毒抗体水平在首次免疫接种后14d开始升高，其HI都不高，90d后，多数抗体水平降低到临界值，在二次加强免疫接种后，抗体水平在14d时开始升高，24d达到高峰，在210d时，多数能维持较高的抗体水平，具有较好的免疫合格率。

2.2 免疫接种剂量试验

用禽流感（H5＋H9）二价灭活苗两种剂量（1.0 mL／羽和0.5mL／羽）免疫接种动物园圈养的8种珍禽后（本试验选用7种珍禽作对照），其饮水、采食及精神状态均正常，无任何明显异常反应。

用SPSS软件对数据进行独立样本t检验，结果表明孔雀、原鸡、东方白鹳、斑头雁两种剂量（1.0 mL／羽和0.5mL／羽）对抗体滴度的影响差异不显著（P＞0.05），而白冠长尾雉、雉鸡、赤麻鸭，1.0 mL／羽和0.5mL／羽两种剂量在首次免疫接种后对抗体滴度的影响差异多数显著（0.01＜P＜0.05），加强免疫接种后对抗体滴度的影响差异多数不显著（P＞0.05）。H5和 H9亚型禽流感分别用1.0 mL／羽及0.5mL／羽两种剂量免疫的抗体消长规律见表5、表6。

表4 白冠长尾雉等珍禽H9亚型禽流感病毒免疫抗体消长规律及免疫合格率Table4 Immune antibody dynamics and antibody qualification rate of avian influenza virus H9antibody in 4species rare birds

2.3 动物园成年珍禽禽流感免疫程序的初步建立

根据禽流感（H5＋H9）二价灭活苗免疫接种动物园成年珍禽的抗体消长规律及免疫接种剂量的比较研究，并结合动物园的实际情况，初步建立成年珍禽禽流感预防的免疫程序：动物园圈养的孔雀、原鸡、东方白鹳、斑头雁4种野生珍禽，免疫效果良好，可每年免疫接种1次；而免疫应答差的珍禽白冠长尾雉、雉鸡、赤麻鸭、鸳鸯在首次免疫接种后1个月，用相同的疫苗加倍剂量进行加强免疫，以后每半年免疫接种1次。为了确保有效的免疫保护，并结合动物的个体情况，孔雀、原鸡、东方白鹳、斑头雁、白冠长尾雉、雉鸡、赤麻鸭、鸳鸯按1.0mL／羽胸部肌肉注射或颈部皮下注射H5N1－H9N2二价灭活苗。

3 讨论

用禽流感H5N1－H9N2二价灭活苗免疫接种动物园圈养的8种野生珍禽，大部分种类的珍禽首次免疫接种后都能同时产生H5和H9亚型禽流感HI抗体，但不同品种，甚至同一品种的不同个体对禽流感H5＋H9二价灭活苗的免疫反应不同。因此，禽流感的免疫要考虑物种的差异，而且对白冠长尾雉等珍禽要定期进行监测免疫抗体水平。

H5、H9亚型禽流感病毒HI抗体的消长规律基本同步。在免疫接种剂量相同的条件下，免疫接种前有基础水平抗体的珍禽，免疫接种后产生的抗体水平比没有基础水平抗体的珍禽高。在研究过程中是以群体动物来看禽流感HI抗体消长规律的，是以禽流感病毒HI效价≥4log2判为免疫合格，但由于动物个体的差异，群体中某些个体可能处于没有被保护的情况，因此，在实际生产中，为了更加的安全，在禽流感HI效价为5log2的时候就应该加强免疫接种。

禽流感H5N1－H9N2二价灭活苗用于动物园的珍禽免疫接种是安全有效的，通过研究初步确定了一个对成年珍禽的免疫程序，由于动物园珍稀野生动物的特殊性，品种多，数量少，研究受到局限，该免疫程序是否最佳还需做进一步深入的研究。

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