六类新药净固片提取物的主要活性成分研究

严启新，高 媛，李 勇，李 姿

净固片为深圳海王药业公司开发的六类抗痔疮新药，处方源于金代四大名医之首的张从正《儒门事亲》中的净固方[1]，以槐花(炒)为主要成分，可治疗“痔漏、下血痒痛”等症。药理学研究表明，其具有显著的抗炎、镇痛、止血、止痒、抗微血管渗透、抗肛门肿胀、促溃疡愈合和体外抑菌等作用，但疗效的主要成分尚不清楚。为此，笔者采用高效液相色谱法(HPLC)及高效液相色谱－液质联用(HPLC－MS)方法，首次研究了净固片的主要活性成分，现报道如下。

1 仪器与试药

Agilent 1100型高效液相色谱仪，包括低压四元梯度泵、二极管阵列检测器、自动进样器、在线脱气机。净固片原料(提取物)，本公司自制，样品A批号为20080324，样品B批号为20080415;异鼠李素对照品(批号为110860－200406)，橙皮苷对照品(批号为110721－200512)，柚皮苷对照品(批号为110722－200610)，芦丁对照品(批号为100080－200707)，槲皮素对照品(批号为100081－200406)，均中国药品生物制品检定所提供;新橙皮苷对照品(Sigma公司，批号为048K1146);乙腈为色谱纯，水为纯净水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

分别称取样品A和B约50 mg，精密称定，置25 mL量瓶中，加适量甲醇，超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液A和B。称取异鼠李素对照品5.05 mg，精密称定，置50 mL量瓶中;称取橙皮苷对照品5.73 mg，精密称定，置100 mL量瓶中;称取新橙皮苷对照品6.18 mg，精密称定，置100 mL量瓶中;称取芦丁对照品11.07 mg，精密称定，置100 mL量瓶中;称取柚皮苷对照品10.08 mg，精密称定，置50 mL量瓶中，加适量甲醇，超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取2 mL，置10 mL量瓶中;称取槲皮素对照品7.18 mg，精密称定，置100 mL量瓶中。分别加适量甲醇于上述量瓶中，超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得各对照品溶液。

2.2 高效液相色谱法定性研究

2.2.1 定性检测

色谱条件:色谱柱为依利特公司Kromasil C18柱(250 mm×4.6mm，5μm)，检测波长为 283nm，柱温 30℃，流动相为 0.05mol/L乙酸铵水溶液(冰醋酸调pH至3.8)－乙腈，梯度洗脱。流动相洗脱程序见表1。

表1 流动相梯度洗脱表(条件一)

测定方法:取供试品溶液及对照品溶液各10μL，注入液相色谱仪。结果见表2。可见样品中均含有芦丁、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、槲皮素等;在该色谱条件下，无法显示异鼠李素对照品。

表2 两种色谱条件下显示的各峰保留时间(min)及成分确认

2.2.2 色谱条件改进

为防止单一色谱条件的偶然性，现改善色谱条件并进行综合比较，观察色谱峰的特征。将2.2.1项下色谱条件中流动相梯度洗脱程序进行改进，见表3。取供试品溶液及对照品溶液各10μL，注入液相色谱仪。结果见表2。可见，样品中均含有芦丁、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、槲皮素等;异鼠李素在该色谱条件中出现，但综合看，为其他杂峰。

2.3 高效液相色谱－液质联用鉴定研究

2.3.1 检测条件

液相色谱条件:Agilent 1100型高效液相色谱仪。色谱柱为依利特公司 Kromasil C18柱(250 mm ×4.6 mm，5μm)，检测波长283 nm，流动相为0.05 mol/L乙酸铵水溶液(冰醋酸调 pH至3.8)－乙腈，梯度洗脱，分离条件仍按2.2.1项下条件一。

表3 流动相梯度洗脱程序改进表(条件二)

质谱条件:Bruker Esquire 2000型质谱仪。ESI源，正离子检测;鞘气(N2)流速30 psi，辅助气(N2)流速10 L/min;碰撞气体为氦气;毛细管温度300℃，毛细管电压－116.7 V;采用全离子扫描方式，扫描范围为50～2 200 m/z。

2.3.2 成分鉴定

从色谱分离图中依次可见5个最主要的色谱峰。在相对保留时间(RT)为 25.873时，为芦丁，分子式和相对分子质量为C27H30O16(610);ESI中，m/z 609.1 为[M －H]+。在 RT 为 41.20时，结合文献[1－2]，可推断可能为异柚皮苷，其分子式和相对分子质量为 C27H32O14(580);ESI中，m/z579.1为[M－H]+。在 RT为48.021时，结合文献[3]，可推断为柚皮苷，其分子式和相对分子质量为 C27H32O14(580)，ESI中，m/z579.1 为[M －H]+。在 RT为53.642时，结合文献，可推断为橙皮苷，其分子式和相对分子质量为 C28H34O15(610);ESI中，m/z579.1为[M －H]+。在 RT 为59.165时，结合文献，可推断可能为新橙皮苷，其分子式和相对分子质量为 C28H34O15(610);ESI中，m/z 609.1为[M－H]+;在RT为77.194时，结合文献，推断可能为槲皮素其分子式和相对分子质量为 C15H12O7(302);ESI中，m/z300.9为[M －H]+，但结合前期对照品的研究，可确定。

3 讨论

本研究结果显示，净固片的主要成分为芦丁(rutin)、柚皮苷(naringin)、橙皮苷(hesperidin)、新橙皮苷(neohesperidin)、槲皮素(quercetin)。治疗痔疮的进口药痔根断和爱脉朗的主要成分为芦丁和柚皮苷，与净固片的主要成分类似。

净固片与两种进口制剂的主要成分类似，说明传统古方的药效学物质基础和现代新药成分具有相似性，也表明了净固片组方的合理性。净固片的主要药理学研究结果也验证了其对痔疮的治疗效果。

[1]张从正.儒门事亲(卷十五:肠风下血)[M].上海:上海科学技术出版社，1990:448.

[2]贾 强，白 杨.枳壳和枳实化学成分的HPLC－ESI－MS鉴定[J].中草药，2005，36(2):169 －172.

[3]周大勇，徐 青，薛高兴.高效液相色谱－电喷雾质谱法测定枳壳中黄酮苷类化合物[J].分析化学，2006，34(9):31 －35.