siRNA沉默Pim-3对T24细胞增殖和细胞周期的影响

何文强，尹继云，孟 晓，王梅叶，张文涛，曲宪东，李南南

武警河南总队医院泌尿外科郑州450052

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一［1-2］，目前主要采用手术、放疗和化疗等手段治疗，但是治疗后极易复发和进展，预后较差。近年来分子靶向治疗作为综合治疗的一个重要手段和新兴治疗模式在临床中受到越来越多的关注，因此寻找治疗膀胱癌的分子靶点具有十分重要的意义。Pim-3激酶是前病毒整合位点莫罗尼鼠白血病病毒家族的成员之一，属于钙/钙调蛋白依赖性激酶成员，具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性［3］。作者利用RNA干扰技术下调膀胱癌T24细胞中Pim-3的表达，研究其对膀胱癌细胞增殖和细胞周期分布的影响，并分析其可能的分子机制，旨在为以Pim-3为靶点的膀胱癌基因治疗提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂 膀胱癌T24细胞购自上海川翔生物科技有限公司;胰蛋白酶和RPMI 1640购自美国Gibco公司、小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司;脂质体LipofectaminTM2000购自美国Invitrogen公司;CCK-8购自上海碧云天生物技术有限公司;Pim-3小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)、对照siRNA、兔抗人多克隆抗体Pim-3、Cyclin D1、Cdk2和P21均购自美国Santa Cruz公司。

1.2 细胞培养和转染 将膀胱癌T24细胞复苏后培养于含体积分数10%小牛血清的RPMI 1640培养基中，细胞分为3组:未处理组(不作任何处理)、对照siRNA组(采用50 nmol/L对照siRNA转染)和Pim-3 siRNA组(利用50 nmol/L Pim-3 siRNA转染)。当T24细胞达到90%左右融合时，按照脂质体LipofectaminTM2000转染试剂操作说明将Pim-3 siRNA和对照siRNA转入T24细胞。

1.3 Western blot检测 Pim-3、CyclinD1、Cdk2 和P21蛋白表达 收集转染后48 h的膀胱癌T24细胞，用细胞裂解液提取总蛋白，然后进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后，取下凝胶电转移到硝酸纤维素膜上。用含50 g/L脱脂奶粉的TBST液封闭NC膜2 h，加入 Pim-3、Cyclin D1、Cdk2、P21 和 β-actin 一抗(均稀释200倍)，4℃摇床过夜孵育。第2天加入二抗室温孵育2 h。将NC膜置于增强化学发光试剂ECL中反应1～3 min，于暗室中利用X射线曝光，常规方法显影定影，显示特异的蛋白信号。蛋白表达的灰度值利用Image-Pro Plus 5.0软件分析，以目的基因与内参β-actin基因灰度值的比值表示蛋白相对表达量。实验重复3次。

1.4 细胞增殖速率检测 分别收集转染后的24、48、72和96 h的膀胱癌T24细胞，当测定增殖速率时，加入终浓度为体积分数10%的CCK-8试剂，于37℃ CO2培养箱中继续孵育3 h后于酶标仪上测定450 nm的吸光度。

1.5 细胞周期检测 收集转染后48 h的膀胱癌T24细胞约1×106个。利用PBS缓冲液漂洗细胞，并置于4℃、体积分数70%的冰乙醇中固定30 min，采用冷PBS漂洗3次，然后将细胞重悬于含40 μg碘化丙啶和100 μg RNase A的PBS溶液中，于37℃孵育30 min。最后采用流式细胞仪检测样品中G0/G1、S和G2/M期细胞数。

1.6 统计学处理 采用SPSS 13.0分析，3组膀胱癌 T24 细胞中 Pim-3、Cyclin D1、Cdk2、P21 蛋白的表达，细胞增殖速率和细胞分布周期的比较采用单因素方差分析和SNK-q检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 3组膀胱癌 T24细胞中 Pim-3、Cyclin D1、Cdk2、P21蛋白的表达 见图1、表1。

图1 3组膀胱癌T24细胞中Pim-3、Cyclin D1、Cdk2、P21 蛋白的表达

表1 3组膀胱癌T24细胞中Pim-3、Cyclin D1、Cdk2、P21 蛋白的表达(n=3)

2.2 3组膀胱癌T24细胞的增殖速率 见表2。

表2 3组膀胱癌T24细胞的增殖速率(n=5)

2.3 3组膀胱癌T24细胞周期分布 见表3。

表3 3组膀胱癌T24细胞周期分布(n=3)%

3 讨论

研究［4-8］表明，原癌基因 Pim-3在肿瘤中的过表达与肿瘤的发生发展密切相关。Pim-3在胃癌组织中的表达明显高于正常胃黏膜组织，且与淋巴结转移和静脉转移密切相关［9］。Pim-3 mRNA和蛋白在所有的胰腺癌细胞系中都有表达，并且和前凋亡蛋白Bad共同发挥作用［6］。以上研究提示Pim-3的高表达在肿瘤的发生发展中可能发挥重要作用，进一步阻断Pim-3可能成为肿瘤分子靶向治疗的一个十分重要的靶点。该研究结果显示，Pim-3 siRNA转染后48 h显著下调了T24细胞中Pim-3蛋白的表达，为后续进一步研究Pim-3的功能提供理论依据。

目前，许多研究［7，10-11］表明，Pim-3 shRNA 处理后在体外通过增加不同类型的肿瘤细胞(包括结肠癌、肝癌和胰腺癌)的凋亡而抑制肿瘤细胞的增殖。与野生型的小鼠相比，采用二乙基亚硝氨(一种潜在的肝癌诱导剂)处理Pim-3的转基因小鼠，在早期能加速肝细胞的增殖［5］。此外，所有的Pim激酶家族成员均能结合苏氨酸残基处磷酸化Cdk抑制因子P27，诱导P27与14-3-3蛋白结合，导致细胞周期分布发生改变［12］。这些研究表明，Pim-3在肿瘤细胞增殖和细胞周期进程中发挥重要作用。该研究结果表明，转染 Pim-3 siRNA后的48～96 h，膀胱癌T24细胞的增殖受到明显的抑制。进一步流式细胞结果显示，Pim-3表达下调能明显诱导T24细胞周期静止在G0/G1期，并降低S期细胞的比率，从而阻断DNA的合成，进一步抑制细胞的增殖。因为细胞增殖抑制和细胞周期分布改变与细胞周期调控蛋白表达的变化密切相关，所以作者利用Western blot检测与细胞增殖和细胞周期密切相关的Cyclin D1、Cdk2和P21蛋白的表达，结果表明，Pim-3表达下调能明显下调Cyclin D1和Cdk2蛋白的表达，但上调P21蛋白的表达，提示Pim-3表达下调介导的增殖抑制和细胞周期静止可能与上述细胞周期调控蛋白表达的变化密切相关，但是其详细的分子机制尚需要进一步探讨。

综上所述，Pim-3 siRNA能有效下调膀胱癌细胞中Pim-3蛋白的表达，其表达下调明显抑制细胞增殖和改变细胞周期的分布，可能与细胞周期调控蛋白表达的变化密切相关，进一步研究膀胱癌中Pim-3的功能有望为以Pim-3为靶点的膀胱癌基因治疗提供新的理论依据。

［1］Ploeg M，Aben KK，Kiemeney LA.The present and future burden of urinary bladder cancer in the world［J］.World J Urol，2009，27(3):289

［2］Parkin DM.The global burden of urinary bladder cancer［J］.Scand J Urol Nephrol Suppl，2008(218):12

［3］Mukaida N，Wang YY，Li YY.Roles of Pim-3，a novel survival kinase，in tumorigenesis［J］.Cancer Sci，2011，102(8):1437

［4］Yang XY，Ren CP，Wang L，et al.Identification of differentially expressed genes in metastatic and non-metastatic nasopharyngeal carcinoma cells by suppression subtractive hybridization［J］.Cell Oncol，2005，27(4):215

［5］Wu Y，Wang YY，Nakamoto Y，et al.Accelerated hepatocellular carcinoma development in mice expressing the Pim-3 transgene selectively in the liver［J］.Oncogene，2010，29(15):2228

［6］Li YY，Wu Y，Tsuneyama K，et al.Essential contribution of Ets-1 to constitutive Pim-3 expression in human pancreatic cancer cells［J］.Cancer Sci，2009，100(3):396

［7］Popivanova BK，Li YY，Zheng H，et al.Proto-oncogene，Pim-3 with serine/threonine kinase activity，is aberrantly expressed in human colon cancer cells and can prevent Bad-mediated apoptosis［J］.Cancer Sci，2007，98(3):321

［8］Zheng HC，Tsuneyama K，Takahashi H，et al.Aberrant Pim-3 expression is involved in gastric adenoma-adenocarcinoma sequence and cancer progression［J］.J Cancer Res Clin Oncol，2008，134(4):481

［9］胡志方，黄缘，钟琼，等.Pim-3异常表达在胃癌中的意义［J］.世界华人消化杂志，2008，16(31):3515

［10］Fujii C，Nakamoto Y，Lu P，et al.Aberrant expression of serine/threonine kinase Pim-3 in hepatocellular carcinoma development and its role in the proliferation of human hepatoma cell lines［J］.Int J Cancer，2005，114(2):209

［11］Li YY，Popivanova BK，Nagai Y，et al.Pim-3，a protooncogene with serine/threonine kinase activity，is aberrantly expressed in human pancreatic cancer and phosphorylates bad to block bad-mediated apoptosis in human pancreatic cancer cell lines［J］.Cancer Res，2006，66(13):6741

［12］Morishita D，Katayama R，Sekimizu K，et al.Pim kinases promote cell cycle progression by phosphorylating and down-regulating p27Kip1 at the transcriptional and posttranscriptional levels［J］.Cancer Res，2008，68(13):5076