食管鳞状细胞癌组织中骨形成蛋白7的表达

严 琳，任景丽，杨鲲鹏，王立东

1)郑州大学第二附属医院胸外科郑州450014 2)郑州大学第二附属医院病理科郑州450014 3)河南省食管癌重点开放实验室郑州450052

食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)是世界上常见的恶性肿瘤之一，具有发展迅速、转移率高、预后差及死亡率高的特点。骨形成蛋白7(bone morphogenetic protein 7，BMP7)是转化生长因子β超家族中的一员［1］，具有调控细胞增殖、分化、凋亡等多种生物学作用，在多种肿瘤的发生、发展甚至转移中起重要作用［2-3］。作者采用免疫组化SP法检测ESCC组织中BMP7蛋白的表达，RT-PCR法检测BMP7 mRNA的表达，探讨其与ESCC的关系。

1 材料与方法

1.1 标本来源 收集郑州大学第二附属医院2009年9月至2011年7月ESCC患者手术切除标本56例，每例标本于手术切除后取癌及距肿瘤边缘＞5 cm的正常组织，冻存于－80℃冰箱中，均经病理证实。患者术前均未行放化疗或其他免疫治疗。56例患者中，男51例，女5例，年龄43～79岁，其中＞60岁24例;组织学分级G1、G239例，G317例;肿瘤浸润深度T1、T226例，T3、T430例;有淋巴结转移33例，无23例;肿瘤分期按国际抗癌联盟食管癌TNM分期标准(2009年第7版)，Ⅰ、Ⅱ期21例，Ⅲ、Ⅳ期35例。

1.2 主要试剂 免疫组化SP检测试剂盒和DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)，鼠抗人BMP7单克隆抗体［生研(上海)生化试剂有限公司］，Trizol试剂(Invitrogen公司)，MMIV 逆转录酶(Promega公司)，PCR引物(北京赛百胜公司)。

1.3 ESCC组织中BMP7蛋白的检测 采用鼠抗人BMP7单克隆抗体及免疫组化SP配套试剂盒检测ESCC组织中BMP7蛋白的表达及分布。常规制片，4 μm厚石蜡切片，操作严格按照说明书进行，一抗按100倍稀释。用已知阳性切片作为阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。光镜下，BMP7阳性信号主要位于胞膜和胞质，表现为浅棕色至深棕色颗粒。于400倍镜下选择5个视野，计数阳性细胞，阳性细胞百分比≥20%即判定为BMP7蛋白表达阳性［4］。

1.4ESCC组织中BMP7 mRNA的检测 提取标本总RNA，反转录得cDNA，以此为模板，进行PCR扩增，以β-actin作为内参。BMP7引物正义链:5’-GGTCATGAGCTTCGTCGTCAACC-3’，反义链:5’-GCAGGAAGAGATCCGATTCC-3’，产物大小 235 bp。β-actin引物正义链:5’-TGTATGCCTCTGGTCGTAC CAC-3’，反 义 链:5’-ACAGAGTACTTGCGCTCAG GAG-3’，产物大小592 bp。反应条件:预变性94℃5 min，变性94℃ 45 s，退火54℃ 45 s，延伸72℃ 1 min，后延伸72℃ 5 min，共30个循环。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳进行检测，采用凝胶成像分析系统进行分析。计算目的基因与β-actin条带灰度值的比值，比值＞1即判定为目的基因mRNA表达阳性。

1.5 统计学处理 采用SPSS 16.0进行数据处理，采用配对χ2检验比较ESCC与正常食管黏膜组织中BMP7蛋白阳性表达率、BMP7 mRNA表达率以及ESCC组织中BMP7蛋白与mRNA表达之间的差异，采用行×列表资料的χ2检验比较ESCC组织中BMP7蛋白阳性表达与临床病理特征之间的关系，检验水准 α=0.05。

2 结果

2.1 ESCC和正常食管黏膜组织中BMP7蛋白的表达 见图1、表1。

2.2 ESCC和正常食管黏膜组织中BMP7 mRNA的表达 见图2、表2。

2.3ESCC组织中BMP7蛋白与mRNA表达的关系 见表3。

图1 ESCC(A)和正常食管黏膜(B)组织中BMP7蛋白的表达(SP，×100)

表1 ESCC和正常食管黏膜组织中BMP7蛋白的表达

图2 ESCC组织BMP7 mRNA RT-PCR扩增结果

表2 ESCC和正常食管黏膜组织中BMP7 mRNA的表达

表3 ESCC组织中BMP7蛋白与mRNA表达的比较

2.4 ESCC组织中BMP7蛋白表达与临床病理特征的关系 ESCC组织中BMP7阳性表达与浸润程度、淋巴结转移及TNM分期有关，而与性别、年龄和组织学分级关系不大，见表4。

表4 BMP7蛋白表达与ESCC患者临床病理特征之间的关系

3 讨论

BMP7是TGF-β超家族的成员，存在于多种组织细胞中，通过与靶细胞表面的受体结合而发挥作用［5］。BMP7受体分为Ⅰ型和Ⅱ型，均属于丝/苏氨酸蛋白激酶受体，BMP7首先与相应的Ⅱ型受体结合，再募集相应的Ⅰ型受体并使之磷酸化，作用于下游的Smad1、Smad5、Smad8 C-末端最后两个丝氨酸残基使其磷酸化，随后作用于共同的对象Smad4，形成复合体并移入核内，启动特定的基因转录，引起相应的生物学效应。

结直肠癌组织中BMP7蛋白表达显著高于癌旁组织［6］，BMP7蛋白的表达增加与结直肠癌浸润深度显著有关［7］。胃癌组织中BMP7蛋白的表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移及静脉侵袭有关［8］。在黑色素瘤的研究［9］中发现，BMP7高表达于恶性黑色素瘤细胞中，可能与促进黑色素瘤细胞的生长并增强其侵袭性，缩短复发时间有关。该研究证实ESCC组织中BMP7蛋白及mRNA的表达均较正常组织上调，提示BMP7可能是通过启动其信号通路活性，使其表达上调，从而促使ESCC的发生。该研究结果还显示，ESCC组织中BMP7蛋白与mRNA的表达差异无统计学意义，BMP7蛋白的表达与肿瘤TNM分期、浸润深度及淋巴结转移有关，这与Megumi等［10］的报道相似，表明BMP7阳性表达与ESCC的侵袭性、浸润和迁移能力等有关联。

然而，另外的研究结果却截然不同，在肾细胞癌中BMP7的高表达与更好的外科预后相关［11］;在正常的前列腺腺体组织中BMP7表达水平较前列腺癌组织高，随着前列腺癌的发生发展，BMP7表达有逐渐降低的趋势［12-14］;另外在骨髓瘤、乳癌的研究［15-16］中均证实BMP7具有抑制肿瘤细胞增殖的作用。

上述研究结果表明，在不同的组织中BMP-7可能是通过与其受体结合后，调节其下游的信号通路，启动不同的基因转录而发挥其不同的生物学效应。

总之，作者认为，BMP7在ESCC组织中表达升高，且与其TNM分期、浸润及淋巴转移有关，有望成为诊断ESCC的一种新的标记物。

［1］Wozney JM，Rosen V，Celeste AJ，et al.Novel regulators of bone formation:molecular clones and activities［J］.Science，1988，242(4885):1528

［2］Yang S，Zhong C，Frenkel B，et al.Diverse biological effect and smad signaling of bone morphogenetic protein 7 in prostate tumor cells［J］.Cancer Res，2005，65(13):5769

［3］Parmiani G，Rodolfo M，Melani C.Immunological gene therapy with ex vivo gene-modified tumor cells:a critique and a reappraisal［J］.Hum Gene Ther，2000，11(9):1269

［4］Rothhammer T，Wild PJ，Meyer S，et al.Bone morphogenetic protein 7(BMP7)expression is a potential novel prognostic marker for recurrence in patients with primary melanoma［J］.Cancer Biomark，2007，3(2):111

［5］Chen D，Zhao M，Mundy GR，et al.Bone morphogenetic proteins［J］.Growth Factors，2004，22(4):233

［6］钱晖，谢颖，彭秀娟，等.BMP7基因检测在结直肠癌和胃癌诊断中的意义［J］.临床检验杂志，2009，27(6):434

［7］Motoyama K，Tanaka F，Kosaka Y，et al.Clinical significance of BMP7 in human colorectal cancer［J］.Ann Surg Oncol，2008，15(5):1530

［8］Aoki M，Ishigami S，Uenosono Y，et al.Expression of BMP-7 in human gastric cancer and its clinical significance［J］.Br J Cancer，2011，104(4):714

［9］Rothhammer T，Poser I，Soncin F，et al.Bone morphogenic proteins are overexpressed in malignant melanoma and promote cell invasion and migration［J］.Cancer Res，2005，65(2):448

［10］Megumi K，Ishigami S，Uchikado Y，et al.Clinicopathological significance of BMP7 expression in esophageal squamous cell carcinoma［J］.Ann Surg Oncol，2012，19(6):2066

［11］Kwak C，Park YH，Kim IY，et al.Expression of bone morphogenetic proteins，the subfamily of the transforming growth factorβ superfamily，in renal cell carcinoma［J］.J Urol，2007，178(3):1062

［12］Masuda H，Fukabori Y，Nakano K，et al.Expression of bone morphogenetic protein-7(BMP-7)in human prostate［J］.Prostate，2004，59(1):101

［13］Miyazaki H，Watabe T，Kitamura T，et al.BMP signals inhibit proliferation and in vivo tumor growth of androgen-insensitive prostate carcinoma cells［J］.Oncogene，2004，23(58):9326

［14］Buijs JT，Rentsch CA，van der Horst G，et al.BMP7，a putative regulator of epithelial homeostasis in the human prostate，is a potent inhibitor of prostate cancer bone metastasis in vivo［J］.Am J Pathol，2007，171(3):1047

［15］Ro TB，Holt RU，Brenne AT，et al.Bone morphogenetic protein-5，-6 and-7 inhibit growth and induce apoptosis in human myeloma cells［J］.Oncogene，2004，23(17):3024

［16］Buijs JT，Henriquez NV，van Overveld PG，et al.Bone morphogenetic protein 7 in the development and treatment of bone metastases from breast cancer［J］.Cancer Res，2007，67(18):8742