HPLC法测定超低温粉碎胎盘粉中尿苷的含量

卞 凌，陈军霞，潘林梅，邱碧菡，李 欢

紫河车(Placenta Hominis)是健康人体的干燥胎盘经炮制而成的贵重补药，有几百年的药用历史。一般取健康妇女分娩的胎盘做药用原料，味甘、咸，性平偏温，归心、肺、肾经，具有温肾补精、益气养血的功能，用于虚劳羸瘦、骨蒸盗汗、咳嗽气喘、食少气短、阳痿遗精的治疗［1-2］。为了能更好地发挥胎盘的功效，笔者采用超低温冷冻干燥提取技术，使胎盘中的活性物质和营养成分浓缩率提高。胎盘的化学成分复杂，包括次黄嘌呤、尿苷、尿嘧啶等。研究报道这些成分对单胺氧化酶(MAO)均具有不同程度的抑制作用，具有抗衰老的生物活性。尿苷作为胎盘中主要药效成分之一［3-5］，含量较高，因此，笔者选择其作为超低温粉碎胎盘粉质量评价的指标，采用HPLC法进行含量测定。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 Waters系列高效液相色谱仪(515 HPLC pump，2487 Dual λ Absorbance Detector，N2000工作站);Blenchtop Cleaners HB2060(汉邦科技)，MJ-500电子天平(CHYO公司);BP211D电子天平(Sartorius)。

1.2 试剂 尿苷标准品(中国药品生物制品检定所);甲醇为色谱纯;乙醇为分析纯(购自江苏汉邦公司);水为娃哈哈纯净水。新鲜胎盘由南京市妇幼保健院健康产妇提供。

2 方法及结果

2.1 样品制备 新鲜胎盘除去羊膜及脐带，反复冲洗至去净血液，获得新鲜干净的胎盘;放置研钵，加入液氮，迅速冷冻，将冻块压碎，并转移至研钵研磨，边研磨边加液氮，直至成细末;将研磨好的胎盘细末转移至固定容器中，低温干燥得超低温粉碎胎盘粉。

2.2 HPLC法样品测定 样品制备:精密称取低温胎盘粉约1.0 g，置于50mL容量瓶中，加入50%乙醇约40mL，超声30min，放冷至室温，再用50%乙醇定容，用0.45μm有机膜滤过。色谱条件:色谱柱:Benetnach C18(250mm×4.6mm，5μm);流动相:甲醇-水(5∶95，v/v);检测波长:254 nm;流速:1.0mL/min;柱温:30℃;进样量:5μL。

2.2.1 线性关系的考察 精密量取尿苷对照品12.55 mg于50mL容量瓶中，加入甲醇适量，超声处理30min，放冷，用甲醇定容，摇匀，即得尿苷溶液0.251 mg/mL，作为储备液。分别稀释2、4、8、16、32倍，以“2.2”项下色谱条件进样测定色谱图，以峰面积(y)对浓度(x)做标准曲线，得尿苷标准曲线y=45882691.7x+262585.7(R2=0.9995)，线性范围为0.0078～0.2510 mg/mL。

2.2.2 精密度实验 取尿苷对照品溶液(0.2510 mg/mL)，连续进样5次，测定尿苷的吸收面积，峰面积的相对标准偏差RSD为2.10%(n=5)。见表1。

2.2.3 稳定性实验 取样品约2 g，加入50%乙醇30mL，超声30min后定容，滤过。取续滤液过0.45μm微孔滤膜。在24 h内每隔4 h测定一次，样品溶液吸收峰面积基本稳定，尿苷峰面积的相对标准偏差RSD为1.52%(n=5)。表明样品在24 h内基本稳定。见表2。

表1 精密度实验结果

表2 稳定性实验结果

2.2.4 重复性实验 取样品约1 g，加入50%乙醇30mL，超声30min后定容，滤过。取续滤液过0.45μm微孔滤膜，按此制备方法制备6份，分别进样，测得峰面积。根据外标法计算该样品中尿苷平均含量为0.0441%，RSD为2.19%。见表3。

表3 重复性实验结果

2.2.5 加样回收实验 称取低温粉0.5 g，共取9份，分别精密加入一定量的尿苷对照品，使其含量达到样品中次黄嘌呤含量的80%、100%、120%，每个浓度做3份，均按上述样品溶液制备方法制备，再按“2.2”项下色谱条件测定，计算加样回收率，结果见表4。

2.2.6 含量测定 取样品1.00 g于50mL容量瓶中，加入50%乙醇适量，超声30min，放冷后定容，滤过。取续滤液过0.45μm微孔滤膜。标品取0.0157 mg/mL的尿苷溶液。分别进样，测得峰面积。以外标一点法计算尿苷含量为0.0462%。

表4 加样回收实验结果

图1 HPLC图谱

3 讨论

大多数中药常温粉碎时，会存在粉碎效率低、软化、熔融、芳香成分及易挥发组分跑失、氧化、细菌污染甚至变色、焦化等问题。采用低温粉碎技术，不仅可以避免上述缺陷，保持药物的有效成分和组成不变，而且有望提高物料细度、流动性等粉体学特征，从而提高药材的使用质量和效率。本文采用HPLC法测定低温粉碎胎盘粉中尿苷的含量，为胎盘的质量控制提供了初步的实验依据。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:238.

［2］吕鹏月.紫河车及其代用品的药理学与质量评价研究［D］.山东中医药大学，2004，4(20):1.

［3］陈军霞，卞凌，潘林梅，等.胎盘超低温粉碎与常规粉碎工艺的比较研究［J］.时珍国医国药，2010，21(12):3194-3195.

［4］王本祥，陈晓光.次黄嘌呤对单胺氧化酶的抑制作用［J］.药学学报，1989，24(8):573-577.

［5］周冉，李淑芬.RP-HPLC同时快速测定鹿茸中尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷含量［J］.药物分析杂志，2009，29(4):575-578.