蒺藜皂苷对正常和2型糖尿病大鼠餐后血糖水平的影响

张素军，冯尚彩

蒺藜(Tribulus terrestris L.)为蒺藜科(Zygophyllaceae)一年生草本植物，其果实为传统中药，临床上用于治疗头痛头晕、目赤翳障、乳痈乳难、风疹瘙痒等症［1］。蒺藜含有的皂苷类成分是其重要的生理活性成分，除具有抗衰老、性强壮、抑癌等作用外，还具有降低空腹血糖的作用［2-4］。但蒺藜皂苷对餐后血糖的影响尚未见报道，本文对此进行了研究，以期为蒺藜皂苷在餐后血糖控制中的作用机理和意义提供实验依据。

1 材料

1.1 药材 蒺藜全草2010年8月采自山东省临沂市，经笔者鉴定为蒺藜科植物蒺藜(Tribulus terrestris L.)，晒干粉碎备用。

1.2 试剂及药品 4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG，Merck公司);对-硝基苯酚(p-nitrophenol，PNP，上海国药化学试剂公司);四氧嘧啶(Alloxan，Sigma公司);阿卡波糖(Acarbose，北京拜尔医药保健有限公司，国药准字H19990205);蒺藜皂苷(Saponins from Tribulus terrestris，STT)，参照褚书地［5］方法自制;葡萄糖酶法测定试剂盒，上海科欣生物技术研究所;其他试剂除特别说明外，均为国产分析纯;水为双蒸水。

1.3 动物 清洁级雄性Wistar大鼠，体质量(200±20)g，由山东鲁抗医药股份有限公司动物中心(济宁市)提供，许可证号 SCXK(鲁)20050017。

1.4 仪器 BS210S电子天平(Sartorius)，RE-2000型旋转蒸发器(上海亚容生化仪器厂)，SHZ-Ⅲ循环水真空泵(上海锦华层析设备厂)，ZK-82A型真空干燥器(上海实验仪器总厂)，电热恒温水浴锅(北京市长风仪器仪表公司)，722分光光度计(上海市第三分析仪器厂)，TL-16R台式高速冷冻离心机(上海市离心机机械研究所)，TGL-16G台式离心机(上海安亭科学仪器厂)，WH-851型旋涡混合器(上海环球物化仪器厂)，玻璃匀浆器。

2 方法

2.1 STT对正常大鼠餐后血糖的影响 大鼠(240～250 g)随机分为6组，每组9只，禁食12 h后，1～3组灌胃葡萄糖(2 g/kg)，同时分别灌胃蒸馏水(对照)、STT(100 mg/kg)和阿卡波糖(25 mg/kg);4～6组灌胃蔗糖(2 g/kg)，同时分别灌胃蒸馏水(对照)、STT(100 mg/kg)和阿卡波糖(25 mg/kg)。60min后尾静脉采血，分离血清，用葡萄糖酶法测定试剂盒测定血糖浓度。

2.2 STT对2型糖尿病大鼠餐后血糖的影响大鼠(180±10)g饲喂高糖高脂饲料(由常规饲料加20%蔗糖、10%猪油、2.5%胆固醇配制而成)4周后，腹腔注射四氧嘧啶(100 mg/kg)，继续饲喂高脂高糖饲料 2周，禁食 12 h，灌胃葡萄糖(2 g/kg)，0、120min 后尾静脉采血，酶法测定血糖浓度。选取0min血糖浓度≥7.0mmol/L而＜10mmol/L同时 120min血糖浓度≥11.1mmol/L而＜20mmol/L的为2型糖尿病模型鼠。糖尿病鼠随机分为6组，每组8只，继续饲喂高脂高糖饲料1周后，禁食12 h，1～3组灌胃葡萄糖(2 g/kg)，同时分别灌胃蒸馏水(对照)、STT(100 mg/kg)和阿卡波糖(25 mg/kg);4～6组灌胃蔗糖(2 g/kg)，同时分别灌胃蒸馏水(对照)、STT(100 mg/kg)和阿卡波糖(25 mg/kg)。60min后尾静脉采血，分离血清，测定血糖浓度。

2.3 STT对α-葡萄糖苷酶活性的影响

2.3.1 大鼠小肠中α-葡萄糖苷酶的提取 正常雄性大鼠，乙醚麻醉，剖开腹腔，剪取十二指肠部分10 cm左右;剖开十二指肠，用冷的0.9%生理盐水充分冲洗，然后用一干净载玻片刮取小肠内表面，将刮取物约按 1∶10(W/V)加入冷的0.1mol/L磷酸缓冲液(pH 6.8)，在冰浴上用玻璃匀浆器匀浆，匀浆液 10000×g离心(4℃)30min，上清液于－20℃保存备用。

2.3.2 标准曲线的制作 用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH 6.8)配置150μmol/L 的PNP，稀释成100、75、50、30、15、0μmol/L。分别取上述 7 种不同浓度的PNP溶液各1mL，加入1mol/L Na2CO3溶液2mL，混匀，在400 nm下测定吸光度(A)，以A值为纵坐标、PNP浓度为横坐标，绘制标准曲线。

2.3.3 酶标准活性的测定 反应体系［磷酸缓冲液(pH 6.8)0.1mol/L ，0.5mL;PNPG 5mmol/L，0.4mL;酶提取液0.1mL］在37℃温育20min后，加入1mol/L Na2CO3溶液2mL终止反应，混匀，以不加酶液为空白(缓冲液体积相应增加)，在400 nm下测定吸光度(A)。

2.3.4 STT对α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定除反应体系中分别加入10、1、0.1 mg/mL的STT溶液和0.1 mg/mL的阿卡波糖溶液0.1mL外(缓冲液体积相应减少)，其他按照2.3.2项下进行，测定400 nm下吸光度(A)。

2.3.5 酶活性抑制率的计算 1个α-葡萄糖苷酶活力单位(U)定义:pH 6.8、37℃时，1min释放1μmol PNP的酶量。则酶活性抑制率(%):［酶标准活性(U)-抑制剂作用下酶活性(U)］/酶标准活性(U)×100%。

2.4 数据处理 实验数据以SPSS统计软件进行单因素方差分析，并以Duncan检验进行多重比较，P＜0.05为差异有统计学意义，结果以表示。

图1 正常大鼠一次性灌胃葡萄糖或蔗糖同时灌胃蒸馏水(对照)、阿卡波糖(25 mg/kg)或STT(100 mg/kg)60min后的血糖水平(，n=9)

图2 2型糖尿病大鼠一次性灌胃葡萄糖或蔗糖同时灌胃蒸馏水(对照)、阿卡波糖(25 mg/kg)或STT(100 mg/kg)60min后的血糖水平(，n=8)

3 结果

3.1 STT对正常大鼠餐后血糖的影响 正常大鼠一次性灌胃蔗糖或葡萄糖同时灌胃STT、阿卡波糖和蒸馏水(对照)，60min后的血糖水平如图1所示。STT显著抑制灌胃蔗糖后血糖水平的升高，血糖水平为对照的70.19%(P＜0.001)，阿卡波糖使灌胃蔗糖后的血糖水平降为对照的72.62%(P＜0.001)。STT和阿卡波糖对灌胃葡萄糖后血糖水平的变化均无显著影响(P＞0.05)。

3.2 STT对2型糖尿病大鼠餐后血糖的影响如图2所示，STT和阿卡波糖均显著抑制2型糖尿病大鼠一次性灌胃蔗糖后血糖水平的升高，60min后的血糖水平分别为对照的68.05%(P＜0.001)和61.90%(P＜0.001);STT和阿卡波糖对灌胃葡萄糖后血糖水平的变化均无显著影响(P＞0.05)。

3.3 STT对α-葡萄糖苷酶活性的体外抑制作用如图3所示，在0.1、1、10 mg/mL的 STT作用下，α-葡萄糖苷酶活性极显著降低(P＜0.001)，其对酶活性的抑制率分别为20.83%、43.73%和52.62%，其中10 mg/mL的STT对酶活性的抑制作用与0.1 mg/mL阿卡波糖的抑制作用相当，后者对酶的抑制率为51.94%。

图3 STT和阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用(，n=5)

4 讨论

餐后高血糖是糖尿病特别是2型糖尿病的重要病理特征。流行病学调查表明，和空腹血糖相比，餐后血糖对2型糖尿病心血管并发症的发生和发展具有更大的相关性。有些个体虽然没有明显的糖尿病特征，但由于胰岛素抵抗等原因，餐后血糖已显著异常，有人称之为“餐后糖尿病”。这种“餐后糖尿病”是动脉粥样硬化等心血管疾病发生和发展的重要基础，并最终加速和导致2型糖尿病的发生。因此，餐后高血糖的及时发现和有效控制，对糖尿病特别是2型糖尿病及其并发症的预防和治疗具有极其重要的作用［6-9］。α-葡萄糖苷酶位于小肠黏膜上皮，是糖类物质消化和吸收的关键酶，能够水解蔗糖、麦芽糖等寡糖类的α-糖苷键，最终产生可被吸收的单糖［10］;α-葡萄糖苷酶抑制剂，如已广泛应用于临床的阿卡波糖［11］，通过对该酶的抑制作用，延迟和降低糖类物质的消化和吸收，从而有效降低餐后血糖水平，在2型糖尿病的治疗中发挥重要作用。本实验发现，从中药蒺藜全草中提取的蒺藜皂苷-STT与卡波糖一样，不仅能够显著降低正常大鼠灌胃蔗糖后血糖水平的升高(图1)，而且能够显著降低2型糖尿病大鼠灌胃蔗糖后的血糖水平的升高(图2)。同时，STT与阿卡波糖对正常和2型糖尿病大鼠灌胃葡萄糖后的血糖变化均无显著性影响(图1、图2)。鉴于STT对餐后血糖的影响与阿卡波糖的作用具有较大的一致性，推测其对餐后血糖水平的影响也是通过对α-葡萄糖苷酶的抑制而发挥作用的。进一步体外实验发现(图3)，STT剂量依赖性地抑制α-葡萄糖苷酶的活性，10 mg/mL的STT即使酶的活性抑制50%以上，与0.1 mg/mL阿卡波糖的作用相当。表明STT对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用有效降低了正常和糖尿病大鼠餐后血糖的升高，为其在2型糖尿病中的进一步研究和应用提供了实验证据。至于STT对α-葡萄糖苷酶作用的确切分子机理和具体作用物质，尚需从生物、化学和药理等方面做进一步研究。

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