依达拉奉对大鼠XRCC1和细胞凋亡的影响

王 智，薛荣亮，赵红霞，高 慧，魏 欣

临床上遇到心跳骤停等危急状况，经过积极抢救后，尽管呼吸心跳恢复，但常遗留不同程度的脑机能障碍，这主要与脑缺血再灌注损伤以及迟发性神经元细胞凋亡有关［1］。神经元细胞凋亡可由多种因素启动，DNA损伤与修复直接关系到细胞结构和功能的恢复。研究发现，DNA修复蛋白表达的逐渐衰减导致细胞凋亡逐渐增多［2］。如能发现对DNA损伤修复及细胞凋亡起保护作用的因素，有可能为临床治疗缺血性脑损伤疾病提供一条新的途径。

近年研究表明，依达拉奉通过清除自由基，抑制脂质过氧化和细胞坏死，从而改善脑缺血及再灌注后的细胞功能，达到脑保护的作用［3］。同时，许多相关研究表明，依达拉奉可以减少自由基对DNA损伤［4-6］。但是其发挥脑保护作用的具体机制尚不清楚，目前鲜有资料报道依达拉奉对全脑缺血/再灌注中DNA损伤与神经元细胞凋亡的影响。本实验建立了全脑缺血/再灌注大鼠模型，拟研究脑缺血敏感区海马CA1区DNA修复蛋白XRCC1表达变化与细胞凋亡的关系及依达拉奉对其的影响，探索依达拉奉脑保护机制，以期为临床治疗脑缺血/再灌注损伤、改善预后提供新的思路和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠108只，鼠龄55～65 d，体质量290～310 g，由西安交通大学医学院动物实验中心提供。术前夜禁食，随意进水。依达拉奉(购自吉林省博大制药有限责任公司)，原位末端标记细胞凋亡检测试剂盒(购自美国Promega公司)，SABC(兔IgG)-POD试剂盒(购自武汉博士德生物工程有限公司)，DAB显色试剂盒、XRCC1兔抗多克隆抗体(均购自北京博奥森生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组 108只大鼠随机分成3组:假手术组(SH组)、缺血/再灌注组(IR组)、依达拉奉干预组(ED组)。每组根据再灌注后处死时间的不同再分为2、6、12、24、48 和 72 h 6 个亚组，每亚组6只大鼠。

1.2.2 模型制备 采用四血管阻塞法［7］建立SD大鼠全脑缺血再灌注损伤模型。IR组和ED组动物予以微动脉夹夹闭颈总动脉5min后，松开动脉夹以恢复脑血流。SH组大鼠仅游离暴露双侧颈总动脉及椎动脉，不予以凝断椎动脉和夹闭双侧颈总动脉处理。SH组和IR组全脑缺血再灌注后，即时分别腹腔注射生理盐水4mL/kg，ED组腹腔注射依达拉奉溶液10 mg/kg。三组大鼠分别于再灌注后2、6、12、24、48、72 h 给予处死。以4%多聚甲醛200mL心脏灌注处死，取出完整大脑，在视交叉后1mm和4mm处各切一刀，取中间小块脑组织(海马头端)，将组织块在4%多聚甲醛液中浸泡，4℃保存3 d后制备切片。

1.2.3 原位细胞凋亡检测法(TUNEL) 取海马冠状石蜡切片，常规二甲苯、乙醇脱蜡至水。蛋白酶K(20 mg/L)室温消化，用甲醇配制的30mL/L过氧化氢消除内源性辣根过氧化酶活性，加末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT)与生物素标记的核苷混合物(biotin-11-dUTP)混合反应进行孵育，再加链霉抗生物素蛋白辣根过氧化物酶溶液(Streptavidin-HRP溶液)进行孵育，用DAB显色，核呈深棕黄色者为凋亡细胞，最后复染、脱水、透明、封片。400倍光镜下观察每张切片海马CA1区，随机选取5个视野，分别计算凋亡细胞数和总细胞数。定量分析方法:光镜下计算凋亡指数(Apoptosis Index，AI)。凋亡指数计算方法:分别计算凋亡细胞数和总细胞数，AI=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.2.4 免疫组织化学检测 取海马冠状石蜡切片，采用SABC法行免疫组化法。切片依次脱蜡至水，30mL/L过氧化氢孵育10min，三蒸水冲洗5min。PBS(pH 7.4)浸泡5min，电炉水浴抗原修复，加热至95℃ 15～20min后，自然冷却至室温。滴加正常山羊封闭血清，室温孵育1 h，浸入勿洗。滴加1∶100的XRCC1多抗，放入4℃冰箱过夜。PBS冲洗5min，3次，擦干切片周围水分后，滴加生物素标记的二抗，37℃温箱孵育1 h;PBS冲洗5min，3次，擦干切片周围水分后，滴加SABC复合物，放入37℃温箱孵育20min。三蒸水洗5min，3次，DAB显色，脱水、透明、封片。切片中显示细胞胞浆黄染、有棕黄色颗粒者为XRCC1阳性细胞。定量分析方法:光镜下计算阳性细胞指数。方法:在400倍光镜下观察切片海马CA1区，随机选取5个视野，分别计算阳性细胞数和总细胞数，阳性细胞率 =阳性细胞数/总细胞数×100%。

2 结果

2.1 TUNEL法 SH组凋亡率较低;IR组凋亡率于缺血再灌注后6 h开始明显增多，48 h凋亡率最高，与SH组比较，IR组凋亡率显著增高(P＜0.01);ED组在6 h后各时点凋亡率较IR组明显降低(P＜0.01)。见表1、图1～图3。

表1 大鼠全脑缺血再灌注后各时点海马CA1区凋亡指数比较

图1 光镜下缺血再灌注48 h SH组海马CA1区细胞凋亡情况(TUNEL染色，×400)

图2 光镜下缺血再灌注48 h IR组海马CA1区细胞凋亡情况(TUNEL染色，×400)

图3 光镜下缺血再灌注48 h ED组海马CA1区细胞凋亡情况(TUNEL染色，×400)

2.2 XRCC1蛋白免疫组化显示，SH组XRCC1蛋白在各时点表达较明显;IR组XRCC1表达在缺血再灌注后2 h开始明显下降，与SH组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。ED组XRCC1表达降低没有IR组明显，在各时点与IR组比较，差异均有统计学意义(P＜0.01)。见表2、图4～图6。

表2 大鼠全脑缺血再灌注后各时点海马CA1区XRCC1阳性细胞率的比较

图4 光镜下缺血再灌注48 h SH组海马CA1区XRCC1表达(免疫组化，×400)

图5 光镜下缺血再灌注48 h IR组海马CA1区XRCC1表达(免疫组化，×400)

图6 光镜下缺血再灌注48 h ED组海马CA1区XRCC1表达(免疫组化，×400)

3 讨论

脑缺血再灌注损伤是一个极为复杂的病理生理过程，其中包括众多环节，如能量代谢障碍、兴奋性氨基酸毒性作用、氧自由基生成、线粒体功能障碍、细胞内钙超载等［9-10］。这些环节互为因果，彼此关联，并相互联系，形成恶性循环，最终造成比缺血更加严重的组织功能损伤。

在对脑缺血再灌注损伤机制的研究中，发现许多因素都可以引起DNA损伤，同时亦会损伤DNA的修复功能［11］，DNA损伤与修复直接关系到细胞结构与功能的恢复，是脑缺血再灌注损伤的关键。脑缺血再灌注损伤中，DNA的损伤和修复功能降低可最终导致神经元细胞凋亡［2］。研究发现，脑缺血/再灌注后的细胞凋亡是一个具有时间依赖性的动态演变过程，尚未凋亡的细胞，随着再灌注时间的延长和DNA损伤的逐渐累积而最终导致凋亡［12］。

X线修复交叉互补组1(X-ray repair cross complementing 1，XRCC1)基因是参与哺乳动物DNA修复的重要修复基因之一，其编码翻译的XRCC1蛋白作为碱基切除修复中介，可调节酶的活性。XRCC1蛋白上调DNA连接酶3、脱嘌呤嘧啶核酸内切酶、多核苷酸激酶，抑制PARP-1/2和DNA聚合酶 β 的活性［13］。因此，XRCC1蛋白通过影响所有参与DNA碱基切除修复的关键酶，在细胞对DNA损伤反应中发挥极其重要的作用。缺乏XRCC1蛋白的细胞死亡率增加10倍，DNA单链损伤的修复率为不缺乏XRCC1蛋白细胞的1/5［14］。有研究应用成年CD-1雄鼠局灶脑缺血再灌注模型、免疫组化和 TUNEL双标，表明失去XRCC1免疫活性神经元同时表达TUNEL阳性，表明XRCC1早期降低先于DNA断裂的发生，并导致随后的细胞凋亡［15］。在缺血脑损伤中，导致XRCC1蛋白下降的具体机制还不清楚，如果能早期发现这些DNA修复功能受损但尚未凋亡的细胞，并积极采取措施使之逆转，则有可能为临床治疗缺血性脑损伤疾病提供一条新的途径。

依达拉奉是一种新型自由基清除剂和抗氧化剂，其分子结构上具有亲脂基团，血脑屏障的通透性高［16-17］。其作为自由基捕获剂，能抑制黄嘌呤氧化酶和次黄嘌呤氧化酶的活性，刺激前列环素的生成，减少炎症介质白细胞三烯生成，降低羟自由基浓度，缩小缺血半暗带发展成梗死的体积［18-19］。Yamamoto 等［20］建立脑缺血模型，于再灌注后静注依达拉奉，并在海马内植入微透析探针，发现依达拉奉可抑制再灌注后羟自由基产物-2，3二羟基苯甲酸(2，3-DHBA)浓度的增加，减少海马锥体细胞凋亡，说明依达拉奉可抑制缺血后海马区迟发性神经细胞死亡。但依达拉奉抑制细胞凋亡的具体机制，特别是在全脑缺血再灌注后对DNA损伤修复有哪些影响，鲜有资料报道。

本试验通过建立全脑缺血模型，给予依达拉奉腹腔注射后，发现脑缺血/再灌注6 h时，海马CA1区凋亡率显著增高，一直持续到72 h。这可能与依达拉奉的药物代谢动力学与有关，与依达拉奉的血药浓度曲线一致［21］。

给予依达拉奉腹腔注射后，脑缺血/再灌注后2 h，缺血区XRCC1蛋白的表达比IR组增多，持续至再灌注后72 h。由此推论，在大鼠全脑缺血再灌注损伤过程中，依达拉奉通过调节DNA修复蛋白XRCC1在脑组织的表达，干扰单链损伤，减少细胞凋亡，对脑缺血/再灌注损伤具有治疗意义。

本研究结果一方面再次论证DNA修复蛋白XRCC1在阻止脑缺血/再灌注诱导的细胞凋亡上起作用这一推论，另一方面提示，依达拉奉通过增强脑缺血/再灌注早期DNA修复蛋白XRCC1的表达而发挥其神经保护作用，这或许是依达拉奉治疗缺血性脑血管病的分子机制之一，但依达拉奉对脑缺血/再灌注后脑细胞中XRCC1的表达发挥调节作用的确切机制尚待进一步研究。

总之，大鼠全脑缺血再灌注时应用依达拉奉，可减缓DNA修复蛋白XRCC1表达的下降，促进DNA损伤的修复，从而阻止锥体细胞凋亡，进而起到脑保护作用。

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