高糖对小鼠足细胞表型转化的诱导作用及机制探讨

刘青娟，张玉军，李建英，付晓辉，姚 芳，吴海江，邢玲玲

(1河北医科大学病理教研室，石家庄050017;2石家庄市人民医院;3河北医科大学第二医院)

近年研究显示，糖尿病肾病(DN)时高糖环境、糖基化终产物、血管内皮生长因子、氧自由基、转化生长因子-β、血管紧张素Ⅱ和机械应力的增加都可以损伤足细胞，而足细胞的损伤与蛋白尿的产生关系密切，在DN发生发展中起关键作用［1～4］。有研究［5，6］显示，与肾近端小管上皮细胞类似，足细胞亦可在病理因素刺激下发生表型转化，即上皮向间充质细胞转分化(EMT)，从而脱离基底膜，导致肾小球滤过屏障发生障碍引起蛋白尿，但有关足细胞表型转化机制的研究较少。近年来，我们的实验研究结果表明，在糖尿病动物及高糖培养的系膜细胞、肾小管上皮细胞中，JAK/STAT信号通路的活性明显增强，且该通路的激活与肾小管上皮细胞表型转化有关。由此我们推测，高糖诱导的足细胞表型转化或许也与JAK/STAT通路有关。2010年9月～2011年10月，我们应用蛋白质酪氨酸激酶(JAK2)的特异性阻断剂 α-氰-(3，4-二羟基)-N-苄基肉桂酰胺(AG490)干预足细胞，观察足细胞自身标志物人肾病蛋白(Nephrin)和间充质细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的变化，探讨高糖诱导足细胞表型转化的机制。

1 材料与方法

1.1 材料 小鼠足细胞株购自中国协和医科大学细胞中心;兔抗Nephrin、α-SMA、β-actin多克隆抗体购自北京博奥森公司，兔抗p-JAK2抗体购自Santa Cruz公司;AG490购自美国Calbiochem公司;逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)试剂为Promega公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与分组 将冻存的足细胞复苏后，置于含 10 U/mL γ-干扰素和 10%胎牛血清的DMEM-F12培养基中，33℃细胞培养箱中培养;传代后转入不含γ-干扰素的培养基中37℃培养10～14 d，使足细胞充分分化后进行后续实验。实验前换无血清培养基孵育12 h，使细胞同步化。将细胞随机分为A、B、C三组，A组常规培养不处理，B组加入终浓度为30 mmol/L的葡萄糖，C组加入终浓度为30 mmol/L的葡萄糖及10 μmol/L的 AG490。

1.2.2 足细胞中Nephrin、α-SMA和p-JAK2蛋白的检测 采用Western blot法。培养48 h后收集细胞，加入蛋白裂解液提取蛋白，用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，－70℃保存。每个样品取50 μg总蛋白，10%SDS-PAGE凝胶电泳后电转移至PVDF膜;5%脱脂奶粉37℃封闭2 h，再分别加入兔抗p-JAK2、α-SMA 多克隆抗体(1∶500稀释)，4 ℃过夜。ECL化学发光法显色，以 β-actin作为内参照。Western blot条带信号强度采用Lab Work 45图像分析软件进行定量分析，测定各条带的积分光密度值(IOD)，以此表示目标蛋白的表达量。

1.2.3 足细胞中 Nephrin、α-SMA mRNA 的检测采用RT-PCR法。Trizol法提取细胞总RNA，用紫外分光光度仪测定其浓度后，在逆转录酶作用下合成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增。18 S rRNA的上下游引物分别为5'-ACA CGG ACA GGA TTG ACA GA-3'、5'-GGA CAT CTA AGG GCA TCA CAG-3'(238 bp)，α-SMA的上下游引物分别为5'-CTG AAG AGC ATC CGA CAC-3'、5'-GAC TCC ATC CCA ATG AAA G-3'(520 bp)，Nephrin的上下游引物分别为 5'-CCC CAA CAT CGA CTT CAC TT-3'、5'-GGC AGG ACA TCC ATG TAG AG-3'(372 bp)。所用引物均由上海捷锐生物公司合成。将PCR产物在2%琼脂糖凝胶中进行电泳，然后置于凝胶图像分析系统(UVP公司，美国)进行吸光度扫描，以18 S rRNA作为内参照校正，用目的基因的吸光度与18 S rRNA吸光度的比值代表目的基因的相对表达量。

1.2.4 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。所得数据以±s表示，多组间比较采用方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组足细胞中 Nephrin、α-SMA、p-JAK2 蛋白的表达量比较 见表1。

表1 各组足细胞中Nephrin、α-SMA、p-JAK2蛋白表达量比较(±s)

表1 各组足细胞中Nephrin、α-SMA、p-JAK2蛋白表达量比较(±s)

注:与 A组比较，*P ＜0.05;与 B 组比较，#P ＜0.05

组别 Nephrin α-SMA p-JAK2 A组0.96±0.01 0.21±0.02 0.39±0.01 B 组 0.58±0.01* 0.66±0.07* 0.71±0.02*C 组 0.87±0.04# 0.35±0.02# 0.41±0.04#

2.2 各组足细胞中Nephrin、α-SMA mRNA的表达量比较 见表2。

表2 各组足细胞中Nephrin、α-SMA mRNA相对表达量比较(±s)

表2 各组足细胞中Nephrin、α-SMA mRNA相对表达量比较(±s)

注:与 A组比较，*P ＜0.05;与 B 组比较，#P ＜0.05

组别 Nephrin mRNA α-SMA mRNA A组1.53±0.04 0.57±0.01 B 组 0.82±0.09* 0.89±0.03*C 组 1.30±0.04# 0.78±0.03#

3 讨论

肾脏纤维化是各种慢性肾脏疾病的最终结局，随着糖尿病发病率的上升，DN逐渐成为导致终末期肾病的主要原因之一。肌成纤维细胞是细胞外基质的主要来源，在肾脏纤维化中发挥着至关重要的作用。正常肾组织中几乎无肌成纤维细胞。大量实验研究表明，EMT是肌成纤维细胞的主要来源。以往的研究更关注肾小管上皮细胞的转分化，而足细胞和肾小管上皮细胞均来源于胚胎中胚层的间叶细胞，因此考虑足细胞和小管上皮细胞一样，在病理条件下具有转分化为间叶细胞的可能性［1］。

近年来，越来越多的研究［5～8］表明，在某些病理因素作用下，肾小球足细胞确实也可发生EMT，即丧失其特异性标志物，表现出转分化的特征，从而在肾小球滤过屏障受损、蛋白尿及肾小球硬化过程中发挥重要作用。DN发病过程中伴随有明显的足细胞形态和功能异常，考虑足细胞EMT是其中的关键病理过程［6］。α-SMA是普遍公认的一种提示上皮细胞发生EMT的标志性蛋白之一。在生理条件下，足细胞不表达α-SMA，其在足细胞中的表达可作为足细胞发生EMT的一个有价值的指标。本研究结果显示，与A组相比，B组在高糖刺激下可使足细胞Nephrin的表达减少而α-SMA表达增加，提示高糖可诱导足细胞发生表型转化。

足细胞转分化后可获得分泌功能，使细胞外基质分泌过多，从而导致肾小球硬化并最终发展至纤维化［9］。逆转足细胞功能损伤可延缓或减轻DN的进展［10］。因此，探讨足细胞转化的机制，并进一步阻断该过程至关重要。JAK/STAT信号通路是细胞因子信号转导的重要通路之一。JAKs家族是一种非受体型酪氨酸蛋白激酶，STATs是JAKs激酶的底物，磷酸化的STATs以二聚体的形式存在并转移到核内调控基因表达。以往对肾小管上皮细胞转化的研究［11，12］表明，JAK/STAT 信号通路在高糖、细胞因子等多种刺激因素诱导上皮转化中均发挥重要作用。由此，我们考虑JAK/STAT信号通路可能也参与了高糖诱导的足细胞转分化。为了验证这一观点，我们首先检测了高糖刺激后足细胞中p-JAK2和p-STAT1的表达，证实高糖可以激活足细胞中的JAK/STAT信号通路。之后我们在高糖诱导足细胞转化的同时采用AG490进行干预，结果发现，与单纯高糖刺激相比，同时加入AG490干预后，在抑制JAK/STAT通路的同时，足细胞中α-SMA蛋白及其mRNA表达明显降低。提示AG490可通过阻断JAK/STAT信号通路抑制高糖诱导的足细胞表型转化。本研究结果为DN蛋白尿的防治提供了实验依据。

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