食管鳞癌组织中PLK1表达变化及其对食管癌细胞侵袭迁移的影响

范平明，郑武平，高炳玉

(海南医学院附属医院，海口570102)

Polo样激酶1(PLK1)是一类广泛存在于真核细胞中呈周期依赖性表达的丝/苏氨酸激酶，与肿瘤的发生、发展密切相关。2006年6月～2012年3月，我们观察了食管鳞癌组织中PLK1的表达变化，及其对食管癌细胞侵袭转移能力的影响，并初步探讨了其可能的机制。

1 资料与方法

1.1 临床资料 食管鳞癌80例，男61例，女19例;年龄25～77岁，平均45岁;术前未行放化疗。于2006年6月～2008年6月行食管癌手术，术中留取肿瘤及癌旁正常组织标本，TNM分期T1～T2期56例，T3～T4期24例;临床分期Ⅰ～Ⅱ期40例，Ⅲ～Ⅳ期40例;病理分级G0～G1级39例，G2～G3级41例;有淋巴结转移48例，无淋巴结转移32例。术后患者均进行化疗、放疗等规范性治疗，随访至2012年3月31日。

1.2 方法

1.2.1 食管鳞癌组织中PLK1的检测 采用免疫组化SP法。组织标本均经10%甲醛固定，常规石蜡包埋，切片厚4 μm;SP染色，抗原修复采用柠檬酸钠缓冲液微波修复;以已知阳性片作阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。PLK1阳性细胞为细胞核深褐色染色。高倍镜下选择5个视野，每个视野计数200个肿瘤细胞，计算阳性细胞所占百分比。阳性细胞百分比＜10%为阴性，≥10%为阳性。

1.2.2 细胞培养与转染 将人食管癌EC9706细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。将细胞以6×105/mL接种于6孔板，每孔1 mL;培养16 h后，观察组用PLK1 siRNA(5'-GGGACATAGCCAAGCTGGTCGAGTACTGGACCAGCTT-GGCTATGTCCC-3'，由Invitrogen公司合成)经脂质体转染EC9706细胞，对照组细胞转染Scrambled siRNA(与人类基因组序列无同源性，由Invitrogen公司合成);继续培养48 h后，将细胞按1∶10传代，然后加入G418进行筛选;每隔2～3 d换液1次，10～14 d有明显克隆形成。

1.2.3 食管癌细胞侵袭及迁移能力的观察 采用Transwell试验。EC9706细胞转染后48 h后，用无血清RPMI1640培养基饥饿12 h，调整细胞浓度为1×106/mL。每个小室加100 μL细胞悬液，下室加600 μL含10%FBS的RPMI1640培养基。其中侵袭实验在小室接种细胞前一晚，将基质胶(Matrigel)用无血清RPMI1640培养基稀释成浓度为1∶7，每个小室加60 μL，而迁移试验不加Matrigel。37℃、5%CO2培养箱中培养，侵袭试验28 h后再行迁移试验20 h;取出小室用90%乙醇固定，0.1%结晶紫溶液染色，置于显微镜下观察并拍照;在相同的低倍视野(×100)下，分别选取视野中央和上下、左右5个视野进行细胞计数;实验重复3次，计算平均值。

1.2.4 食管癌细胞中 PLK1、MMP-2、MMP-9 的检测采用Western blot法。用蛋白裂解液(Thermo公司)提取两组培养细胞总蛋白，用分光光度计测蛋白浓度。每孔上样20 μg，进行SDS-PAGE电泳 (浓缩胶8%，分离胶12%);蛋白分离后半干转至PVDF膜(30 V，42 min)，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入兔抗人 PLK1 抗体、MMP-2、MMP-9，以鼠抗人β-actin抗体作为内参。4℃摇床过夜，再加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG;室温孵育 2 h，ECL化学发光显色。用 One-Dscan软件检测目的蛋白和内参蛋白电泳条带的灰度值，以目的蛋白与内参蛋白灰度比值表示目的蛋白表达量;实验重复3次，求平均值。

1.2.5 统计学方法 采用 SPSS16.0统计软件。PLK1表达与临床病理参数的关系用χ2检验，采用Kaplan-Meier法进行生存分析;组间计量资料比较用方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 食管鳞癌及癌旁组织中PLK1的表达情况食管鳞癌组织中PLK1阳性表达53例(66.3%)，高于癌旁组织中的27 例(33.7%)，P ＜0.05。

2.2 PLK1表达与食管鳞癌临床病理参数的关系PLK1表达与食管鳞癌淋巴结转移及临床分期有关(P均 ＜0.05)，与患者的年龄、TNM 分期、肿瘤病理分级无关(P均＜0.05)。见表1。

表1 PLK1表达与食管鳞癌临床病理参数的关系

2.3 PLK1表达与食管癌患者预后的关系 PLK1阴性者5年生存率为62%，高于PLK1阳性者的39%，P＜0.05。以食管癌临床预后作为因变量，以有关影响因素作为自变量进行多因素Cox回归分析。结果显示，临床分期、淋巴结转移、病理分级、PLK1表达均为食管癌预后的独立危险因素。详见表2。

表2 食管鳞癌患者预后影响因素的Cox回归分析

2.3 PLK1表达对食管癌细胞侵袭迁移能力的影响 观察组细胞侵袭迁移个数分别为(120±6)、(269±8)个/HP，对照组分别为(468±11)、(780±12)个/HP;两组比较，P 均 ＜0.05。

2.4 敲降PLK1表达对相关蛋白表达的影响 观察组PLK1、MMP-2、MMP-9灰度比值分别为0.10±0.03、0.40±0.02、0.87±0.05，对照组分别为 0.96±0.05、0.98± 0.07、0.89± 0.06;两组 PLK1、MMP-2灰度比值比较，P 均 ＜0.05。

3 讨论

PLK1在细胞有丝分裂中扮演重要角色，与细胞有丝分裂期多个事件密切相关，如中心体复制、纺锤体形成、染色体分离以及胞质分裂等［1］。近年来研究［2～4］发现，PLK1在多种实体肿瘤组织中高表达，提示其与肿瘤发生相关;进一步分析发现，PLK1高表达与一些肿瘤组织分级、恶性程度及肿瘤患者的预后密切相关。本研究发现，PLK1在食管鳞癌组织中的表达水平明显高于癌旁正常组织，其高表达与淋巴结转移和临床分期有关，而与肿瘤分化程度无关。生存分析发现，PLK1高表达者的生存期显著低于低表达者;进一步的多因素分析表明，PLK1表达、临床分期、病理分级和淋巴结转移都是食管癌患者预后的独立影响因素。以上这些结果表明，PLK1在多种肿瘤的发生、发展中可能发挥重要作用。其表达升高可能有助于恶性肿瘤细胞逃脱检测点监控，突变基因得以复制，导致肿瘤形成。

鉴于PLK1表达与食管癌的淋巴结转移和患者的不良预后有关，我们进一步检测了PLK1表达对食管癌细胞侵袭迁移能力的影响。结果发现，敲降PLK1表达，可显著降低食管癌细胞的侵袭迁移能力。肿瘤的侵袭迁移须完成三个过程，即降解细胞外基质(ECM)的蛋白质、黏附ECM生长、离开ECM向其他器官迁移［5］。在此过程中，MMP起关键作用。MMP是一种重要的蛋白水解酶，现已发现26种亚型，MMP既参与ECM的降解，又可促进肿瘤细胞的黏附及运动［6］。其中MMP-2在肿瘤的浸润和转移中发挥关键作用［7］。ECM降解是肿瘤浸润与转移的关键环节，该过程的完成主要依靠蛋白水解酶的降解作用。MMP-2以酶原的形式分泌，被激活之后形成Ⅳ型胶原酶，降解、破坏靠近肿瘤表面的ECM和基底膜，然后肿瘤细胞沿着缺失的基底膜向周围组织浸润，最终导致肿瘤的浸润和迁移［8，9］。MMP-9可降解基底膜中的主要成分Ⅳ型胶原及明胶等，具有调节细胞迁移、促进肿瘤生长和血管生成等重要作用［10，11］。为了进一步研究PLK1影响食管癌细胞侵袭迁移的分子机理，我们观察了PLK1表达对与肿瘤侵袭迁移密切相关的MMP-2、MMP-9表达的影响。结果发现，敲降PLK1表达可抑制MMP-2的表达水平，提示PLK1对食管癌细胞侵袭迁移能力的影响可能是通过影响MMP-2的表达而实现的，但这种作用是直接的还是间接的需要进一步深入研究。

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