红景天苷联合HGF对脐血间充质干细胞向肝样细胞分化的诱导作用观察

黄 伟，钱海鑫，苗宗宁，张学光

(1苏州大学附属第一医院，江苏苏州215002;2无锡市第三人民医院;3苏州大学)

间充质干细胞(MSCs)具有多向分化能力，在特定的培养条件下可以分化为骨、脂肪、软骨等多种细胞［1～5］。研究［6，7］发现，在体外脐血 MSCs 可被诱导分化为肝样细胞，并能合成释放谷丙转氨酶(ALT)、白蛋白(ALB)等。实验中常用肝细胞生长因子(HGF)作为诱导剂，但其诱导方向存在多样性及不确定性，诱导分化为肝样细胞的数量较少。红景天苷是中药红景天的提取物，常用于肝病的治疗，对肝细胞再生具有一定作用。2011年12月～2012年5月，我们采用红景天苷联合HGF诱导脐血MSCs向肝样细胞分化，观察二者联合应用的诱导效果。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 人脐血 MSCs，DMEM/F12(Gibco公司)，多聚甲醛(上海化学试剂厂)，胰蛋白酶(Sigma公司)，多聚赖氨酸(Nvitrogen公司);红景天苷(中国药品生物制品鉴定所)，HGF(Epro Tech公司);肝功能检测试剂盒(上海化学试剂厂)，全自动生化分析仪(Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与分组 取生长状态良好的第5代脐血 MSCs［8］，用 0.25% 胰蛋白酶、0.01%EDTA混合液消化;PBS洗涤2遍，离心、收集细胞，用工作液(DMEM/F12)将细胞浓度调整为1×104/mL;以1 mL/孔接种6孔板，培养4 d。取贴壁生长状态良好的细胞，用含5%FBS的DMEM/F12换液。将脐血MSCs随机分成4组，A组不处理，B组分别加入5(B1)、10(B2)、20 μmol/L(B3)的红景天苷 5 μL，C 组分别加入 5(C1)、10(C2)、20 ng/mL(C3)的HGF 5 μL，D 组分别加入 B1+C1(D1)、B2+C2(D2)、B3+C3(D3)的红景天苷和HGF。

1.2.2 细胞形态观察及肝样细胞计数 分别于培养第1、7、14、21天，用倒置相差显微镜观察细胞形态变化;选取3个高倍镜视野，计数肝样细胞(三角形、多角形或类圆形细胞)的数量，取平均值。

1.2.3 细胞上清液中ALT、ALB检测方法 分别于培养第1、7、14、21 天，取细胞悬液;以 1 500 r/min离心15 min，毛细吸管吸取上清液备用。采用全自动生化分析仪检测上清液中的ALT，以溴甲酚绿法检测上清液中的ALB。

1.2.4 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量资料以±s表示，组间比较采用t检验。P≤0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞形态变化及肝样细胞数量比较 A组细胞均呈长梭形，各时点无明显变化;B、C、D组第7天梭形细胞两端逐渐变短，第14、21天细胞由长梭形变为三角形、多角形或类圆形的肝样细胞。A组各时点高倍镜下均未见肝样细胞，B、C、D组在第7、14、21天均可见肝样细胞(P 均 ＜0.05)，并随时间延长而增加(P均＜0.05);D组肝样细胞数量高于同时点的B、C组(P均＜0.05)，并随药物浓度增加而增加。D2、D3与D1比较，P均＜0.05，而D3与 D2比较，P ＞0.05。见表1。

表1 不同时点各组肝样细胞数量比较(个/HP，±s)

表1 不同时点各组肝样细胞数量比较(个/HP，±s)

组别 肝样细胞第1天 第7天 第14天 第21天A组0000 B组B1 0 111± 7.6 118± 7.9 135±10.1 B2 0 121± 8.3 128± 8.7 145±11.1 B3 0 119± 7.8 125± 7.9 140±10.6 C组C1 0 102± 7.4 123± 7.6 138±10.2 C2 0 117± 7.6 131± 7.9 144±10.6 C3 0 123± 8.5 127± 8.0 141±10.6 D组D1 0 131± 9.4 145±11.6 160±14.2 D2 0 145±11.4 157±13.6 179±17.2 D3 0 147±11.5 155±13.3 170±16.8

2.2 不同时点各组细胞上清液中ALT、ALB水平比较 A组各时点细胞上清液中均未检测到ALT、ALB，B、C、D 组第 14、21 天均检测到 ALT、ALB(P均 ＜0.05)，并随时间延长而升高(P均 ＜0.05);D组ALT、ALB水平均高于同时点的B、C组(P均＜0.05)，且随作用药物浓度的增加而升高，D2、D3与D1比较，P 均 ＜0.05，而 D3 与 D2比较，P ＞0.05。见表2。

表2 不同时点各组细胞上清液中ALT、ALB水平比较(±s)

表2 不同时点各组细胞上清液中ALT、ALB水平比较(±s)

组别 ALT(μg/L)ALB(g/L)第1天 第7天 第14天 第21天 第1天 第7天 第14天 第21天A组00000000 B组B1 0 84.5± 8.1 344.7± 8.5 233.8± 9.1 0 0 0.901±0.018 1.956±0.045 B2 0 114.9± 9.1 511.1±13.3 340.9±11.7 0 0 1.361±0.029 2.559±0.060 B3 0 125.1±12.6 491.6±12.3 362.1±10.1 0 0 1.301±0.031 2.541±0.045 C组C1 0 83.5± 7.9 334.9± 8.2 254.2± 8.8 0 0 0.889±0.020 1.972±0.041 C2 0 116.3± 9.6 491.3±11.6 352.6±10.7 0 0 1.371±0.031 2.561±0.054 C3 0 126.8±10.3 492.5±11.8 383.3±11.5 0 0 1.298±0.035 2.531±0.048 D组D1 0 230.7±12.5 947.2±19.9 647.6±13.2 0 0 1.802±0.040 3.967±0.079 D2 0 335.3±12.6 1 266.2±22.7 867.1±12.8 0 0 2.752±0.059 5.271±0.098 D3 0 336.1±12.3 1 167.5±23.2 868.2±14.2 0 0 2.650±0.062 5.302±0.052

3 讨论

肝硬化是一种常见的慢性肝病，尤其是晚期肝硬化，保守治疗效果欠佳，病死率居高不下。原位肝移植是治疗晚期肝硬化比较有效的措施，但因肝源缺乏、费用昂贵、移植排斥反应及长期应用免疫抑制剂引起并发症等，限制了其广泛应用。近年来，对干细胞的应用研究为解决这一问题带来了新的希望，特别是脐血MSCs在体外经诱导可分化成肝样细胞，可代替部分甚至全部的肝脏，为细胞移植治疗晚期肝硬化开辟了新的途径。

在对细胞向肝样细胞进行诱导的研究过程中，常用的诱导剂是HGF。HGF因最初被发现可剌激肝细胞合成DNA而得名，是肝脏发育及肝再生过程中最基本的细胞因子［9，10］;同时HGF是很强的促肝细胞增殖因子，不仅能刺激肝细胞的再生，促进肝功能恢复，而且可改善肝纤维化，在损伤因子刺激时保护肝细胞功能［11，12］。HGF是个多效应的生长因子，除了诱导干细胞向肝样细胞分化外，还能诱导干细胞向血管内皮细胞、消化道黏膜细胞、子宫内膜细胞甚至神经胶质瘤细胞等方向分化。HGF作用的多效性相应降低了干细胞肝向分化的专一性，从而使我们所得到的肝样细胞的数量低于预期［13］。

红景天苷是中药红景天的提取物，能清除自由基，抑制氧化应激损伤。其在肝脏损伤的临床治疗中有一定的应用，对肝功能具有广泛而独到的保护作用。本研究结果显示，单独应用红景天苷即可诱导脐血MSCs向肝样细胞分化，并在一定的浓度范围内呈剂量依赖性。其机制可能为:①红景天苷通过阻断干细胞膜上的TGFB-Smad信号传导通路，抑制了干细胞向肝星状细胞的分化与增殖，保证了干细胞在向肝样细胞分化的确定性。②红景天苷可明显上调肝再生增长因子(ALR)的水平。ALR作为特异的生长因子，能明显促进肝细胞的再生而不向其他类型的细胞分化。③有研究报道，在红景天苷诱导MSCs肝向分化的实验中，加入HGFR、胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)、磷脂酰肌醇-3-磷酸激酶(PI3K)3条信号转导通路的阻断剂，结果显示诱导后的细胞对肝细胞标志物的表达明显下降。提示红景天苷诱导MSCs肝向分化是通过以上3条信号通路来实现的［14］。本研究发现，红景天苷联合HGF可增强脐血MSCs诱导分化为肝样细胞的作用，其机制可能为红景天苷抑制了HGF诱导干细胞向其他方向分化的潜能，从而保证了干细胞向肝样细胞分化的方向性［15］。

［1］Iguchi A，Kobayashi R，Sato TZ，et al.Successful report of reduced-intensity stem cell transplantation from unrelated umbilical cord blood in a girl with chronic active epstein-barr virus infection［J］.Clin Lab Observ，2006，28(4):254.

［2］Reyes M，Lund T，Lenvik T，et al.Purification and ex vivo expansion of postnatal human marrow mesodermal progenitor cells［J］.Blood，2001，98(12):2615-2625.

［3］Albella B，Segovia JC，Guenechea G，et al.Exvivo expansion of hematopoietic stem cells［J］.Methods Mol Biol，2010，45(3):266-278.

［4］Jones EA，Kinsey SE，English A，et al.Isolation and characterization of bone marrow multipotential mesenchymal progenitor cells［J］.Arthritis Rheum，2002，46(12):3349-3360.

［5］Sekiya I，Larson BL，Smith JR，et al.Expansion of human adult stem cells from bone marrow stromal:conditions that maximize the yields of early progenitors and evaluate their qullity［J］.Stem Cells，2002，20(6):530-541.

［6］Ylöstalo J，Smith JR，Pochampally RR，et al.Use of differentiating adult stem cells(marrow stromal cells)to identify new downstream target genes for transcription factors［J］.Stem Cells，2006，24(3):642-652.

［7］Monsonego A，Imitola J，Zota V，et al.Microglia-mediated nitric oxide cytotoxicity of T cells following amyloid beta-peptide presentation to Th1 cells［J］.J Immunol，2003，171(5):2216-2224.

［8］Huang W，Miao ZN，Chen L，et al.Brain-derived neurotrophic factor，ciliary neurotrophic factor and their combination for in vitro differentiation of human umbilical blood-derived mesenchymal stem cells into nerve-like cells［J］.J Clin Rehab Tis Engin Res，2010，14(19):3606-3609.

［9］Jaenisch R，Young R.Stem cells，the molecular circuitry of pluripotency and nuclear reprogramming［J］.Cell，2008，132(4):567-852.

［10］Dejosez M，Zwaka TP.Pluripotency and nuclear reprogramming［J］.Annu Rev Biochem，2012，81(11):737-765.

［11］Lemaigre FP.Mechanisms of liver development:concepts for understanding liver disorders and design of novel therapies［J］.Gastroenterology，2009，137(1):62-79.

［12］Roelandt P，Pauwelyn KA，Sancho-Bru P，et al.Human embryonic and rat adult stem cells with primitive endoderm-like phenotype can be fated to definitive endoderm，and finally functional hepatocyte-like cells［J］.PLoS One，2010，5(8):12101.

［13］Sancho-Bru P，Roelandt P，Narain N，et al.Directed Differentiation of Murine Induced Pluripotent Stem Cells to Functional Hepatocyte-like Cells［J］.J Hepatol，2011，54(1):98-107.

［14］Chivu M，Dima SO，Stancu CI，et al.In vit ro hepat ic differentiation of human bone marrow mesen chymal st em cells under differential exposure to liver specific factors［J］.Transl Res，2009，154(3):122-132.

［15］Oida T，Weiner HL.Depletion of TGF-b from fetal bovine serum［J］.J Immunol Methods，2010，362(1-2):195-198.