肾炎四味片对糖尿病大鼠肾脏足细胞紧密连接蛋白ZO-1表达的影响

殷玉红 田小燕 宋海燕 纪英 杨颖博 王桂东 李艳稳

在糖尿病肾病中，蛋白尿是其目前公认的早期临床表现，并且是促进糖尿病肾病进展的重要因素之一。紧密连接蛋白的异常表达与滤过膜的通透性改变的发生、发展密切相关。ZO-1表达于多种上皮细胞，是维持黏膜通透性的重要组成部分。实验证明ZO-1参与了缺血缺氧诱导的血脑屏障通透性增加［1］，并且在肠黏膜通透性增加中也发挥重要作用［2］。在糖尿病肾病模型中发现，ZO-1在糖尿病肾病发生、发展过程中其表达逐步减少，与尿蛋白呈负相关［3］。肾炎四味片具有减少尿蛋白、保护肾功能的作用，在糖尿病肾病中的治疗作用已得到广泛认可，但其作用机制目前尚未完全明了。本实验应用肾炎四味片干预糖尿病大鼠，探讨其是否通过调节ZO-1的表达来减轻糖尿病大鼠尿蛋白的排泄及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性Sprague-Dawley大鼠36只，体重180～220 g，8周龄，由河北医科大学动物中心提供。随机分成3组:正常组，糖尿病组和肾炎四味片组，每组12只。所有动物均自由摄取饮食及饮水，喂标准大鼠食物。

1.1.1 糖尿病动物模型建立:腹腔一次性注射链脲佐菌素(2%STZ)溶液，72 h后，采取尾静脉血测定血糖值。以血糖≥16.7 mmol/L作为大鼠糖尿病成模标准。大鼠自由进标准饮食，实验期间不给予任何降糖药物。

1.1.2 药物干预:肾炎四味片对患者的剂量为3 g，3次/d。依据定量药理学中有关不同种属动物间的剂量换算方法推算大鼠的用药剂量为10mg·kg－1·d－1，每天给予糖尿病组大鼠灌胃1次。其余2组均灌胃等量自来水。于成模8、12周处死各组大鼠6只。

1.2 标本采集

1.2.1 尿液标本:实验8、12周末，3组随机各取6只大鼠，收集并记录大鼠24 h总尿量，留取5ml，测尿白蛋白排泄率。

1.2.2 血液标本:糖尿病大鼠模型建立72 h后，取大鼠尾尖血，做血糖测定。在实验8、12周末，从每组随机取出的6只大鼠，乙醚吸入麻醉，称体重，断头取血，做血肌酐测定。

1.2.3 肾组织的处理:取肾组织，体积小于2cm×2cm×0.4cm，用多聚甲醛液固定，做免疫组织化学检查;剩余的肾脏组织置于－80℃液氮速冻后保存，做PCR。

1.3 观察指标及检测方法

1.3.1 血尿生化指标测定:血肌酐、尿肌酐测定均用Ci-8200全自动生化仪，尿白蛋白排泄率测定采用放免法。

1.3.2 免疫组化:石蜡切片常规脱蜡至水，3%过氧化氢温室孵育10～15min，微波修复抗原10min，用正常小牛血清封闭非特异性抗原，滴加一抗(兔抗大鼠ZO-1多克隆抗体)，4°C孵育过夜。加入生物素标记的二抗工作液，室温下孵育30min。滴加DAB显色液，苏木素复染，常规梯度脱水、二甲苯透明、中型树胶封片。阴性对照组用PBS代替一抗。阳性反应部位为棕褐色。应用病理图像分析系统做半定量分析，每张切片随机选取10个肾小球(200倍)，测量积分光密度。

1.3.3 透射电镜检查(TEM):取肾皮质组织，切成1 mm×1 mm×1 mm小块，用2.5%戊二醛固定后，1%饿酸后固定，超薄切片，醋酸铀-柠檬酸铅染色，H-7500透射电镜观察肾小球超微结构的改变。

1.4 RT-PCR 应用Trizol试剂提取总RNA，用分光光度仪检测其含量，RNA的吸光度(A)260 nm/280 nm比值均在1.8～2.0。分装，置于 －80°C 冰箱保存。0.2 μg总 RNA 以 Random 9mers为反转录引物合成cDNA。以cDNA为模板，Taq DNA多聚酶催化下，进行 PCR扩增。引物序列为:上游引物:5’-TGCTCCAGCAGGTCCTAAGT-3，下 游 引 物:5’-TGGTAGCTGAGGGCAGAACT-3，产物191bp。β-actin引物序列:上游引物:5’-AGCCATGTACGTTAGCCATCC-3，下 游 引 物:5’-CTCT-CAGCTGTGGTGGTGAA-3，产物228bp。ZO-1基因扩增条件为:94℃ 5min，然后 94℃30 s，59℃45 s，72℃30 s(30 个循环)，72℃延伸5min。扩增目的片段长度为191 bp。β-actin基因扩增条件为:94℃ 5min，然后 94℃ 30 s，62℃ 45 s，72℃ 30 s(31个循环)，72℃延伸5min。扩增目的片段长度为228 bp。PCR产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳，紫外灯下拍照，用凝胶成像系统进行分析，以与β-actin吸光度的比值表示其相对含量。

1.5 统计学分析应用SAS 9.0统计软件，计量资料以表示，采用Pearson方法进行相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肾重/体重、血糖、24 h尿蛋白定量、肌酐清除率的变化实验8、12周时，血糖、肾重/体重、肌酐清除率和24 h尿蛋白，糖尿病组和肾炎四味片组明显高于正常组(P＜0.01);肾炎四味片组较糖尿病组低(P＜0.05)。见表1。

表1 生化指标的变化 n=6，

表1 生化指标的变化 n=6，

注:与正常组比较，*P ＜0.01;与糖尿病组比较，#P ＜0.05

组别 血糖(mmol/L)24 h尿蛋白(mg) 肌酐清除率(ml/min) 肾重/体重(mg/g)正常组8 周 6.11 ±0.22 13.8 ±1.8 2.84 ±1.12 4.0 ±0.412 周 6.21 ±0.25 23.4 ±7.4 2.92 ±0.99 4.2 ±0.4糖尿病组8 周 28.37 ±5.65* 276.0 ±71.3* 5.87 ±0.26* 7.0 ±0.3*12 周 26.68 ±6.18* 320.0 ±64.8* 5.95 ±0.21* 7.1 ±0.4*肾炎四味片组8 周 26.68 ±6.57* 140.7 ±11.1*# 4.68 ±0.37*# 5.7 ±0.4*#12 周 26.79 ±6.03* 226.7 ±50.9*# 4.89 ±0.34*# 5.8 ±0.4*#

2.2 病理组织学改变 光镜检查:PAS染色显示糖尿病组肾小球直径均增大，PAS红染区均明显增宽，12周时变化较8周时加重，正常组无上述变化。肾炎四味片组较糖尿病组变化减轻。电镜检查:8周时糖尿病组肾小球基底膜明显不规则增厚，部分裂孔隔膜消失、足突融合，系膜区增宽，细胞外基质增多，毛细血管部分内皮细胞窗孔结构消失，12周时变化则更为明显。肾炎四味片组变化较糖尿病组明显减轻，正常组无上述变化。

2.3 肾皮质ZO-1蛋白表达 免疫组化染色显示正常组大鼠肾组织ZO-1沿肾小球毛细血管袢呈均匀的点线状分布。8、12周时，糖尿病组ZO-1染色强度较正常组明显降低(P＜0.01)。8周时肾炎四味片组ZO-1表达较糖尿病组明显增加(P＜0.05)，与正常组比较，差异无统计学意义(P ＞0.05)。而12周时肾炎四味片组ZO-1表达较糖尿病组增加，差异有统计学意义(P ＜0.05)。见表2。

表2 ZO-1蛋白表达变化 n=6，

表2 ZO-1蛋白表达变化 n=6，

注:与正常组比较，*P ＜0.01;与糖尿病组比较，#P ＜0.05

组别ZO-1正常组8周20.9 ±7.412 周 21.5 ±7.5糖尿病组8周7.4 ±1.8*12 周 7.2 ±3.8*肾炎四味片组8周12.8 ±6.4*#12 周 9.8 ±1.4*#

2.4 肾皮质ZO-1 mRNA的表达 8周时，与正常组比较，糖尿病组ZO-1 mRNA表达明显降低(P＜0.01)，肾炎四味片组ZO-1 mRNA表达较糖尿病组增加(P＜0.05)。12周时糖尿病组ZO-1 mRNA表达进一步降低(P＜0.01)，肾炎四味片组其表达虽增加，差异却无统计学意义(P＞0.05)。见表3。

表3 ZO-1 mRNA/β-actin mRNA表达变化 n=6，

表3 ZO-1 mRNA/β-actin mRNA表达变化 n=6，

注:与正常组比较，*P ＜0.01;与糖尿病组比较，#P ＜0.05

组别 ZO-1 mRNA/β-actin mRNA 0.31 ±0.02正常组8 周 0.59 ±0.0312 周 0.59 ±0.02糖尿病组8 周 0.48 ±0.02*12 周 0.28 ±0.01*肾炎四味片组8 周 0.55 ±0.07*#12周

3 讨论

足细胞之间通过裂孔隔膜相连，是肾小球滤过膜的最外层细胞，足细胞之间连接的完整性对肾小球滤过膜通透性起着重要作用。ZO-1是第1个发现的紧密连接相关蛋白，属于跨膜蛋白，可以起到连接跨膜蛋白、occluden和肌动蛋白细胞骨架的作用，对于细胞间紧密连接的形成具有非常重要的作用。实验证实ZO-1在脑皮质、肺组织及耳蜗、肠黏膜上皮细胞均有表达，且参与缺血、缺氧诱导的血脑屏障通透性增加［1］，酒精诱导的肠黏膜上皮细胞通透性增加［2］。ZO-1在肾小球则主要集中于足细胞足突胞质侧，在裂孔隔膜附近表达。

ZO-1属于鸟苷酸激酶家族，含PDZ区、SH3区及鸟苷酸区，与足细胞骨架蛋白-f-肌动蛋白、α-actinin-4以及裂孔隔膜分子(neph-1)相连。其在紧密连接的组装及发挥正确功能中具有重要作用。ZO-1的第1个功能区可和neph-1羧基端的最后3个氨基酸结合和相互作用，显著增加neph-1胞内功能区酪氨酸的磷酸化，改变neph-1的磷酸化状态及诱导其信号传导;ZO-1和actin细胞骨架相互作用并将其相关蛋白连接到actin细胞骨架上，这对维持足突结构的完整性尤其重要［4］。Rincon在1型及2型糖尿病动物模型及暴露于高糖的肾小球上皮细胞中均发现ZO-1表达的减少，应用免疫金电镜观察到ZO-1的表达有从胞膜到胞质的改变，同时足细胞对血浆白蛋白的通透性增加［5］，这与我们观察到的结果一致［3］。

糖尿病肾病的发生与其肾组织内炎性细胞浸润有关。Sassy等［6］在1型糖尿病模型中发现在糖尿病肾病发生过程中存在炎性介质与巨噬细胞的动态变化，在第1天，肾小球内白细胞介素-1(IL-1)，细胞间黏附因子(ICAM-1)表达增加，第2天其相应的mRNA表达开始增加;Chow等［7］在db/db小鼠糖尿病模型(Ⅱ型糖尿病)中发现随着糖尿病时间的延长，肾小球及肾小管-间质巨噬细胞浸润逐渐增多，并与血糖、血红蛋白A1c(HbA1c)、尿白蛋白、血肌酐等水平呈正相关。

肾炎四味片由细梗胡枝子、石韦、黄芪、黄芩等药物组成。主要功效为活血化瘀，清热解毒，补肾益气，临床上用于治疗慢性肾炎，疗效确切。具有减少尿蛋白，保护肾功能的作用。黄酮类化合物为细梗胡枝子的主要有效成分，可通过抑制白介素-8(IL-8)，TNF-α的分泌，从而调整免疫系统，减轻炎性细胞在肾内的积聚。余凌等［8］应用肾病综合征鼠模型证实黄芪当归合剂具有与ACEI类药物相似的肾脏保护作用，主要通过减轻肾小管间质损伤来发挥作用。黄芪多糖可明显降低肾皮质Na+-K+ATP酶活性，从而防止肾功能失代偿来发挥肾脏保护作用。另有报道:黄芪总皂甙、白术糖复合物、黄酮组成的复方能促进ZO-1蛋白的表达［9］。而在本实验中发现肾炎四味片可改善ZO-1表达的降低，延缓肾脏病进展，起到肾脏保护作用。

紧密连接蛋白ZO-1在肾脏存在于肾小球足细胞的紧密连接中，其存在及正确定位对于肾小球滤过膜的通透性的保持具有重要作用。肾炎四味片具有肾脏保护作用，一方面通过减轻肾脏炎性介质的积聚发挥作用，另一方面还可改善ZO-1的表达从而发挥肾保护作用。

1 吴丽文，尹飞，彭镜，等.紧密连接蛋白ZO-1、occludin和actin参与缺血缺氧诱导的血脑屏障通透性增加.中国当代儿科杂志，2008，4:513-516.

2 高志光，秦环龙.肠上皮细胞紧密连接的生物学功能及在肠屏障中的作用.肠外与肠内营养，2005，12:299.

3 殷玉红，李英.ZO-1在糖尿病大鼠肾组织中的表达及贝那普利对其的干预作用.中国中西医结合肾病杂志，2009，8:678-682.

4 Gonzalez-Mariscal L，Betanzos A，Avila-Flores A.Maguk proteins:structure and role in the tight junction.Semin Cell Dev Biol，2006，11:315-324.

5 Hernan Rincon-Choles，Tetyana L，Vasylyeva，et al.ZO-1 Expression and Phosphorylation in Diabetic.Nephropathy Diabetes，2006，55:894-900.

6 Sassy PC，Heudes D，Mandet C，et al.Early glomerular macrophage recruitment in streptozotocin-induced diabetic rats.Diabetes，2000，49:466-475.

7 Chow F，Ozols E，David J，et al.Macrophage in mouse type 2 diabetic nephropathy:Correlation with diabetic state and progressive renal injury.Kidney Int，2004，65:116-128.

8 余凌，张俊峰，李京子，等.黄芪当归合剂防治肾病综合症鼠进行性肾小管间质损伤.中华肾脏病杂志，2000，5:282-286.

9 李秋霞，罗茂林，李茹柳，等.紧密连接蛋白ZO-1研究概述.广州中医药大学学报，2007，11:523-526.