不同超声辐照联合超声造影剂对人孕早期绒毛组织的损伤作用

超声造影剂的使用可为超声诊断提供全新的影像学信息，尤其在增强血流显像方面提供了丰富的诊断信息[1]。应用实时超声造影模式可动态观察病灶灌注全过程，并通过灌注顺序和模式判断病变性质，从而提高诊断率，现已用于各种疾病的诊断和治疗。在产科，可通过观察造影剂对胎盘的灌注与灌注缺失判断胎盘剥离大小、缺血区域及胎盘植入子宫的部位及深度，诊断胎盘早剥、胎盘梗死与胎盘植入[2,3]。目前已经证实彩色多普勒超声可导致胚胎组织细胞凋亡及超微结构发生改变，超声辐照联合超声造影剂对动物胚胎组织的影响已有研究报道[4]，但是对于人胚胎组织的影响还缺乏临床试验依据。本研究旨在通过研究不同机械指数（mechanical index, MI）的超声造影对人孕早期胎儿绒毛组织的影响，并测定凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达，探讨其对孕早期胎盘细胞凋亡的影响。

1 资料与方法

1.1 研究对象 2008-01～10在鄂尔多斯市中心医院妇产科就诊、尿妊娠试验阳性且自愿要求行人工流产的妊娠40～60d的36例健康早孕者。纳入标准：①月经周期正常，末次月经记忆准确。②半年内无有害理化物质接触史。③无特殊用药史。④夫妇双方均无烟酒嗜好。⑤无急、慢性疾病。排除标准：①宫外孕。②既往有阴道流血。③有自然流产史。④有家庭遗传病史。⑤带环妊娠。36例患者，年龄18～35岁，平均（27.33±5.18）岁。超声检查确定孕囊张力良好，孕囊大小符合孕周。本研究经医院伦理委员会批准，所有受试者均知情并签署知情同意书。

1.2 仪器与试剂 Philips iu22超声诊断仪；C5-2宽频探头，探头频率2～5MHz； H-700 HITACHI透射电镜；Olympus BX41光学显微镜。Bracco公司注射用六氟化硫微泡（SonoVueTM）造影剂；福州迈新生物技术公司鼠抗人Bcl-2单克隆抗体、SP试剂盒及DAB显色剂。

1.3 实验方法

1.3.1 分组 按就诊顺序随机将36例孕妇分为对照组、低机械指数造影组和高机械指数造影组，低机械指数造影组再分为4个亚组；每组6例受试者。

1.3.2 造影剂配制 注射用六氟化硫微泡（含SF6气体59mg，冻干粉25mg）1支，使用前向小瓶内注入注射用生理盐水5ml，用力振荡至冻干粉末完全分散。

1.3.3 孕囊造影 ①对照组：经二维超声确认为宫内妊娠后24h内行人工流产，取绒毛组织。②低机械指数造影组：探及孕囊后分别将成像模式切换到MI＝0.07、0.09、0.13、0.15的机器自带的实时造影成像条件，肘静脉团注2ml造影剂后追加注射5ml生理盐水，照射10min，24h内行人工流产术，取绒毛组织。③高机械指数造影组：MI＝1.0，照射期间击破再灌注3次，其余步骤同上。

1.3.4 透射电镜观察 各组受试者流产后绒毛组织立即用4℃冰生理盐水漂洗，随即用3%戊二醛预固定（取大小约0.1mm3），4℃保存。送电镜中心经PBS缓冲液冲洗、1%锇酸后固定、冲洗、逐级丙酮脱水、Epon812包埋、聚合、常规半薄切片、光学定位、超薄切片、铅染色，透射电镜观察结果并摄片。

1.3.5 免疫组化检测 各组受试者流产后绒毛组织立即用4℃冰生理盐水漂洗，以10%中性甲醛固定，4℃保存，石蜡包埋、切片。免疫组化检测采用SP法，按试剂盒说明操作，检测Bcl-2蛋白的表达。免疫组化表达强度用JD801图像分析软件分析。

1.4 统计学方法 采用SPSS 11.0软件，计量资料数据以±s 表示，符合正态分布并经方差齐性检验后行单因素方差分析，计数资料采用Fisher确切概率法分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组绒毛组织的超微结构 电镜结果显示，对照组中有1例微绒毛排列紊乱，部分消失、断裂，其余5例胚胎绒毛组织超微结构正常（图1A、B）；低机械指数造影组各亚组中，MI＝0.07组中有1例微绒毛排列紊乱，部分细胞糖原增多；MI＝0.09组中2例微绒毛扭曲，排列紊乱，其中1例合体滋养层细胞胞质内出现大空泡；MI＝0.13组中1例可见部分微绒毛粗细不均匀，合体滋养层细胞出现核周空泡，1例微绒毛分布不均匀，合体滋养层细胞胞质内可见多数大空泡；MI＝0.15组中1例微绒毛排列结构紊乱，合体滋养细胞内可见大空泡，细胞核内染色质边集，1例微绒毛稀少，部分断裂，合体滋养细胞核内染色质固缩；对照组与低机械指数造影组间绒毛超微结构异常率比较差异无统计学意义[16.7%（1/6）对29.2%（7/24）]（P＞0.05）。高机械指数造影组中3例微绒毛出现断裂、丢失，部分空泡化；4例合体滋养层细胞核肿胀、空泡现象严重、胞质空泡化；3例出现染色质边集、滋养细胞膜破裂，胞质外溢，线粒体肿胀，嵴部分消失（图1C～E），失去正常结构；1例微绒毛断裂，合体滋养层、细胞滋养层结构紊乱，界限不清。超微结构异常率为100%（6/6），明显高于对照组和低机械指数造影组（P＜0.05）。

2.2 绒毛组织Bcl-2蛋白的表达 免疫组化染色显示Bcl-2蛋白阳性产物呈棕黄色或棕褐色，表达于合体滋养层细胞，主要存在于胞质中，见图2。每张切片在光镜下随机选取5个视野，经JD801图像分析软件得出平均灰度值，见表1。

由表1可见，高机械指数造影组绒毛合体滋养层细胞Bcl-2蛋白表达较对照组及低机械指数造影组明显减少（F＝454.02,P＜0.05），凋亡的抑制作用减弱，促使合体滋养细胞发生凋亡，而其余各组Bcl-2蛋白表达差异无统计学意义（F＝0.76,P＞0.05）。

3 讨论

表1 各组绒毛组织Bcl-2蛋白表达比较（±s, n＝6）

表1 各组绒毛组织Bcl-2蛋白表达比较（±s, n＝6）

注：（1）与高机械指数造影组比较，P＜0.05

分组 灰度值（%）对照组 99.31±0.78（1）低机械指数组MI＝0.07 100.27±1.75（1）MI＝0.09 99.32±0.92（1）MI＝0.13 99.83±0.93（1）MI＝0.15 100.24±1.52（1）高机械指数造影组（MI＝1.0） 113.66±5.18

胚胎绒毛来源于滋养层，是受精卵有丝分裂形成的衍生物，具有与胚胎及胎儿同样的遗传信息，是维持早孕胚胎发育的重要组织，一旦绒毛出现损伤，将对胎儿有近期或远期影响[5]。孕早期是胎儿各脏器分化发育的关键时期，此期胚胎组织娇嫩，容易在各种理化因素的影响下造成损伤，导致胎儿出生后体质下降。此时实施超声造影，超声造影剂微泡作为空化核在液体中能大大增强空化效应，并可降低超声空化阈值，对毛细血管及周围组织产生一定的生物学效应，是否会影响胎儿继续发育尚缺乏可靠依据，因此造影剂在产科应用中的安全性备受关注。

3.1 超声联合超声造影剂的生物学效应 超声空化效应是一种集聚能量的有效方法，它把超声场中低能量密度变换为气泡内部及其周围高能量密度特性，能量被集聚到极小的体积内，在气泡爆裂和振动时产生猛烈的作用，它是液体中高强度超声应用的基础，并能引起机体、细胞及微生物损伤和破坏。生物体内产生空化效应的空化核很少，而超声造影剂微泡作为空化核在液体中受声波辐射后产生共振破裂，能明显增强超声空化效应，并可降低超声空化阈值。动物实验显示，在其他影响因素不变的情况下，对比超声对组织的损伤与机械指数有关[6]。机械指数在超声造影中主要反映组织中产生空穴效应的倾向，与造影剂微泡的破裂有关[7]，不同的机械指数对微泡造影剂的影响各异，从而对局部组织产生的生物学效应也不尽相同。

3.2 不同机械指数超声造影对孕早期绒毛超微结构的影响 在实施造影过程中，无论低机械指数还是高机械指数，六氟化硫微泡造影剂都不能通过胎盘屏障，只存在于母体血液循环中。从超微结构来看，早期胎盘膜由合体滋养层、细胞滋养层和基膜、绒毛结缔组织及毛细血管基膜和内皮组成。如果在造影过程中发生了空化效应，胎盘母体面毛细血管壁和滋养细胞会依次受累，母体面血管壁内皮细胞坏死破裂，红细胞外溢，滋养细胞坏死。各低机械指数的超声造影由于造影剂的使用，增加了空化核，空化阈值降低，产生的空化效应对人早孕绒毛超微结构存在一定的影响，但对绒毛的损伤程度较小。高机械指数的超声辐照联合造影剂大大增加了超声波的空化效应，此时即发生了瞬时空化，且伴有冲击波、高速微流，使局部产生大量自由基，同时超氧化物歧化酶活性下降，清除自由基能力降低，大量堆积的自由基可使细胞膜上的多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化，脂质过氧化可使细胞通透性增强，线粒体膨胀，酶失去活性等。因此，处于空化中心附近的胚胎绒毛组织会受到严重损伤，最终导致早孕绒毛多发性损伤直至破坏。

电镜结果显示，随机械指数的增加，绒毛的损伤程度从外到内逐渐加重，与武艳玲[8]的研究结果一致。损伤最重的是合体滋养层细胞表面的微绒毛，合体滋养层内胞质空泡化，只有在高机械指数下，细胞滋养层细胞及绒毛中轴间质细胞才有损伤。

3.3 不同机械指数超声造影对孕早期绒毛Bcl-2蛋白表达的影响 凋亡在胎盘组织中是常见的生理过程，在整个妊娠过程中，时空调控的细胞凋亡在绒毛发育、母体对胎儿免疫耐受中起重要作用。妊娠早期内细胞群增殖分化为胚外滋养层，通过凋亡维持一定的内细胞群细胞数，防止胚外滋养层异位表达，这是受精卵种植后正常发育所必需的。这种细胞增殖与凋亡的时空调控有赖于胎盘组织中凋亡促进与抑制因子的协调作用。

凋亡的诱导和激活可由不同的刺激触发，如生长因子的撤退、特殊受体和配体的衔接以及轻微的损伤性刺激等。Smith等[9]报道，在人类早孕胎盘合体滋养层中检测到细胞凋亡，并观察到滋养层细胞大量增殖，部分细胞分化，融合形成合体滋养层，然后部分合体滋养层细胞凋亡，从胎盘上脱落进入母体循环系统，胎盘形态的维持依赖于胎盘细胞增殖与凋亡的动态平衡。妊娠早期凋亡发生在母儿双方接触时，在种植、蜕膜化和胚胎的发育成长中起重要作用，凋亡可能在绒毛组织结构改建及功能完善等方面发挥一定的作用[10]。

本研究结果显示，Bcl-2蛋白表达定位于绒毛合体滋养层细胞，在细胞滋养层细胞中不表达，且人早孕绒毛合体滋养细胞Bcl-2蛋白表达与超声造影机械指数相关，在低机械指数条件下其变化较小，但在高机械指数条件下表达明显减少。有学者认为，Bcl-2蛋白于孕5～7周在合体滋养层中高表达，可能对这些细胞有保护作用，使其不发生凋亡，有利于滋养层细胞的存活，使妊娠早期胚胎发育得到充足的营养和氧供[11,12]。本研究结果显示，超声辐照联合超声造影剂条件下，机械指数的大小可通过上述生物学效应影响人早孕绒毛合体滋养细胞Bcl-2蛋白的表达，高机械指数的超声造影使其表达下降，对凋亡的抑制作用减弱，促使合体滋养细胞发生凋亡，引起胎盘组织细胞增殖与凋亡的平衡紊乱。此时，胚胎生长发育的内环境遭到破坏，势必会影响胚胎的正常发育，使流产、胎儿出生质量下降、早产、胎儿生长受限等发生的可能性增加[13]。与对照组比较，低机械指数造影组的Bcl-2蛋白表达量变化不大。目前临床超声造影都是应用低机械指数实时超声造影模式对疾病进行诊断。本研究结果证实，低机械指数的诊断性超声造影对人早孕绒毛胎盘合体滋养细胞Bcl-2蛋白的表达几乎无影响。

综上所述，不同机械指数的超声造影对人早孕胚胎产生影响，其病理改变主要发生于微绒毛、合体滋养层细胞，其次是细胞滋养层，在低机械指数下，其对绒毛组织的损伤较小；在高机械指数下，绒毛组织损伤较严重。就本研究结果而言，低机械指数超声造影在产科应用中较安全，但由于本研究样本量较少，安全性问题仍需进一步观察。值得一提的是，用于临床诊断的超声造影是在低机械指数条件下进行的，其产生的生物学效应对周围组织的损伤较小，但应用超声造影检查仍应坚持以“尽可能小的辐射强度及尽可能短的辐射时间获得必要的诊断信息”为原则。超声辐照联合超声造影剂对人类胚胎产生的影响是否具有可重复性尚需进一步深入研究。

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