人类大鼠肉瘤蛋白同源蛋白和高迁移率族蛋白A1在垂体腺瘤中的表达与侵袭性的关系☆

垂体腺瘤属颅内常见良性肿瘤，但约1／3的肿瘤呈侵袭性发展，可侵犯海绵窦、蝶窦、下丘脑等周围组织结构，使得手术全切除困难，患者术后常需放射治疗、药物治疗等综合治疗。尽管如此，侵袭性垂体腺瘤患者仍有较高的复发率。因此，探寻侵袭性垂体腺瘤的发病机制一直是研究的热点。近年来，在研究肿瘤侵袭性行为相关的靶点中发现：HRAS和HMGA1在细胞内信号传递和细胞增殖过程中起着关键和核心作用，与肿瘤发生密切相关，同时可作为判断肿瘤侵袭性程度的可靠生物学指标［1，2］。因此本研究将以 HRAS 和 HMGA1为研究靶点，检测二者分别在侵袭性、非侵袭性垂体腺瘤中的表达情况，并探讨二者与垂体腺瘤侵袭性行为发生的关系。

1 材料与方法

1.1 临床资料 收集2011年8月至2012年5月重庆医科大学附属第一医院神经外科60例垂体腺瘤患者的术后组织标本（经患者知情同意后进行相关实验），其中男25例，女35例，年龄16～72岁，平均年龄45.2岁。侵袭性垂体腺瘤的判断标准：①本研究采用Wilson改良的Hardy分类法［3］将Ⅲ～Ⅳ级或C、D、E期的肿瘤归为侵袭性腺瘤；②术前影像学改变，CT及MRI可见海绵窦、鞍旁及下丘脑等邻近结构的破坏；③术中所取鞍底骨质或邻近硬脑膜经病理学证实有肿瘤细胞侵犯；④术中见鞍底骨质及硬脑膜被侵袭破坏，肿瘤突入蝶窦腔或侵入鞍旁的血管神经。符合其中之一者即可确定为侵袭性垂体腺瘤。60例标本中，侵袭性垂体腺瘤病例标本28例，非侵袭性垂体腺瘤病例标本32例。所有病例术前有完善的影像学及内分泌检查资料，术后经病理诊断确诊。手术时取所需组织用生理盐水洗净积血，一部分置入4％多聚甲醛溶液内固定，一部分直接放入冻存管中，剩余一部分放入经焦碳酸二乙酯（DEPC）水处理过的冻存管中，后两者置入液氮备用。

1.2 逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测HRAS和HMGA1 mRNA表达 按Trizol试剂（购于大连宝生物工程公司）说明书步骤提取总RNA，－80℃冰箱保存备用。提取的RNA含量通过752型紫外分光光度计测定260 nm吸收值，按每OD260相当 40 μg RNA 计算 RNA 的产率，OD260在1.8～2.0视为抽提的RNA纯度很高。PCR引物由大连宝生物工程公司设计并合成。HRAS上游引物序列5-GCGATGACGGAATATAAGG-3，下游引物序列 5-ACTGGTGGATGTCCTCAA-3，产物长度 289 bp；HMGA1上游引物序列5-TCTCTGCTCCTTCACTGT-3，下游引物序列5-CTCCTGCCTTCCTGTAAC-3，产物长度 277 bp；β-actin上游引物序列5-GACCCAGATCATGTTTGAGACC-3，下游引物序列5-ATCTCCTTCTGCATCCTGTCG-3，产物长度594 bp；β-actin上游引物序列 5-TGCGTGACATTAAGGAGAA-3，下游引物序列5-AAGGAAGGCT GGAAGAGT-3，产物长度172 bp。RT扩增条件：37℃15 min，85℃5 s；PCR扩增条件： 94℃30 s，54℃ 30 s，72℃ 20 s，循环 35次，72℃延伸 5 min。产物经2％琼脂糖凝胶电泳分离；紫外灯下拍照，采用Quantity-one图像分析软件比较电泳条带光密度值，获得HRAS和HMGA1的相对表达量。

1.3 免疫组织化学 SABC法检测 HRAS和HMGA1蛋白表达 标本经4％甲醛固定，常规石蜡包埋连续切片，HE染色和免疫组化染色。微波炉加热修复，以3％H2O2溶液封闭内源性过氧化物酶，参照SP试剂盒（购置于北京中杉公司）产品说明书依次进行山羊血清封闭，以PBS代替一抗作阴性对照，一抗（HRAS和HMGA1单克隆抗体购置于美国ABCAM公司），4℃过夜，山羊抗兔二抗孵育，链霉素亲生物素蛋白－过氧化酶孵育等处理。DAB（购置于北京中杉公司）显色后，经苏木素复染、盐酸酒精分化，碳酸锂返蓝，酒精脱水、透明、中性树胶封片后于显微镜下进行观察。

根据IRS（immunoreactive score）半定量法计分：①染色深度，无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；②阳性细胞比例：在高倍（400×）镜下随机观察5个视野，每个视野计数200个细胞，计算各视野中阳性细胞数的平均百分比，作为该切片的阳性细胞百分比。5％以下为0分，5％～25％为 1分，26％ ～50％为2分，51％～75％为3分，75％以上为4分。两项计分结果相加，0分计为（－），1～ 2分计为（＋），3～ 6分计为（＋＋），6 分以上计为（＋＋＋）。

1.4 Western Blot法检测 HRAS和 HMGA1蛋白表达 提取侵袭性及非侵袭性垂体腺瘤组织标本中的蛋白成分；BCA法测定蛋白浓度，加入样品缓冲液，置于沸水浴中加热5 min；制备15％的分离胶和5％浓缩胶；加样电泳（浓缩胶80 V，30 min；分离胶 120 V，90 min）；电泳后湿转至硝酸纤维素膜上（110 mA，150 min）；5％脱脂牛奶室温封闭 2 h；5％脱脂牛奶稀释一抗（1∶500～1∶1000），室温孵育2～4 h或4℃过夜；5％脱脂牛奶稀释二抗（1∶2000～ 4000），室温孵育 1～2 h；TBST 洗膜 3次；显影、定影。采用Image J分析软件比较免疫印迹条带灰度值。

1.5 统计学方法 采用PASW Statistics 18行两独立样本 t检验、χ2检验，检测水准 α ＝0.05。

2 结果

2.1 RT-PCR结果 HRAS在侵袭性垂体腺瘤中的 mRNA 表达（0.96±0.16），明显高于其在非侵袭性垂体腺瘤中的表达（0.54±0.15），差别具有统计学意义（t＝10.437，P＜0.05），见图 1；HMGA1在侵袭性垂体腺瘤中的mRNA表达（1.12±0.20），明显高于其在非侵袭性垂体腺瘤中的表达（0.52±0.19），差别具有统计学意义（t＝11.742，P＜0.05），见图 2。

2.2 免疫组织化学结果 HRAS阳性表达为垂体腺瘤细胞质内棕黄色颗粒，分布于淡蓝色细胞核周围。在侵袭性和非侵袭性垂体腺瘤组织中HRAS的阳性表达率分别为22／28和15／32，两组比较差异具有统计学意义（χ2＝6.35，P＜0.05）。HMGA1阳性表达可见细胞核内棕黄色颗粒，阴性表达者细胞核呈淡蓝色。在侵袭性和非侵袭性垂体腺瘤组织中 HMGA1的阳性表达率分别为 20／28和14／32，两组比较差异具有统计学意义（χ2＝4.66，P＜0.05），见图 3。

2.3 Western Blot结果 HRAS在侵袭性、非侵袭性垂体腺瘤组织中免疫印迹条带灰度值分别是（1.25±0.16）、（0.76±0.10）（t＝14.848，P ＜0.05）；HMGA1在侵袭性、非侵袭性垂体腺瘤组织中免疫印迹条带灰度值分别是（0.98±0.12）、（0.66±0.09）（t＝11.852，P＜0.05），见图 4。

3 讨论

图1 RT-PCR检测HRAS在侵袭性和非侵袭性垂体腺瘤组织中的表达。M：marker；1、2：侵袭性垂体腺瘤；3、4：非侵袭性垂体腺瘤

图2 RT-PCR检测HMGA1在侵袭性和非侵袭性垂体腺瘤组织中的表达。M：marker，1、2：侵袭性垂体腺瘤，3、4、5：非侵袭性垂体腺瘤

HRAS是RAS家族主要成员之一，它在细胞增殖、分化、凋亡等基本生理功能中起着重要作用。作为一个常见的癌基因，它参与了众多肿瘤的发生。Yong［1］等对HRAS的分子结构功能进行研究发现，由166位至189位的氨基酸组成的高变区（HRV区），是引起人乳腺细胞侵袭性生长与发生迁移的结构基础。而位于HRV区C-端的第173位和174位脯氨酸残基，则是促成HRAS激活及促进人乳腺细胞侵袭性生长的关键。HRAS磷酸化激活下游信号分子也是导致肿瘤发生的常见机制。在HRAS诱导老鼠皮肤癌的模型中发现，凋亡相关基因PI3K的催化亚基p110α（由PIK3CA编码）是RAS发挥关键作用的一个效应子［4］。HRAS诱导肿瘤细胞的侵袭性生长还与激活基质金属蛋白酶家族中MMP-2和MMP-9成员有关［5－6］。基质金属蛋白酶可通过降解基质胶原等结构蛋白成分，溶解破坏基底膜和细胞外基质，使肿瘤细胞向周围组织浸润。在本课题组前期的研究中发现MMP-2和MMP-9是促进侵袭性垂体腺瘤发生的重要原因［7－8］。在本研究中，HRAS在侵袭性、非侵袭性垂体腺瘤中的mRNA表达分别是（0.96±0.16）、（0.54±0.15）（P＜0.05），在组织中阳性表达率分别为22／28和15／32（P＜0.05），免疫印迹条带灰度值分别是（1.25±0.16）、（0.76±0.10）（P＜0.05）。这些结果充分说明HRAS在侵袭性垂体腺瘤组织中的表达量显著高于非侵袭垂体腺瘤组织。根据目前的研究，我们推测，HRAS表达升高可能引起基质金属蛋白酶的分泌，从而使垂体腺瘤细胞外基质降解，参与其侵袭性行为的发生。我们先前的研究还发现自噬基因Beclin-1表达水平降低与垂体腺瘤侵袭性行为的发生密切相关，而HRAS能通过直接抑制自噬相关基因Beclin-1的表达，抑制自噬溶酶体的形成，引起细胞自噬性死亡水平降低，导致肿瘤恶性增殖［9－10］。

图3 免疫组化检测HRAS和HMGA1在侵袭性和非侵袭性垂体腺瘤组织中的表达。A：垂体腺瘤组织HE染色（400×）；B：垂体腺瘤组织阴性表达（400×）；C：侵袭性垂体腺瘤中HRAS阳性表达（400×）；D：非侵袭性垂体腺瘤 HRAS阳性表达（400×）；E：侵袭性垂体腺瘤中HMGA1阳性表达（400×）；非侵袭性垂体腺瘤HMGA1阳性表达（400×）

图4 Western Blot检测HRAS和HMGA1在侵袭性和非侵袭性垂体腺瘤组织中的表达。1、2为侵袭性垂体腺瘤；3、4为非侵袭性垂体腺瘤

高迁移率蛋白家族（HMG）是结构性转录因子，作为细胞核内非组蛋白，通过腺嘌呤－胸腺嘧啶结合元件同富含腺嘌呤－胸腺嘧啶的DNA链小沟结合。HMGA1是HMG家族成员之一，可调控多种基因转录进而参与肿瘤的形成和转移［2］。研究发现，HMGA1抑制可维持上皮的极性和完整性并限制细胞增殖的E－钙粘蛋白表达，E－钙粘蛋白表达减少将导致肿瘤细胞间粘附力丧失，从而引起肿瘤发生侵袭及转移。稳定转染HMGA1基因的NIH3T3细胞克隆，细胞生长增殖速度加快，可诱导正常NIH3T3细胞恶性转化［11］。在来源于低分化、转移性的结肠癌细胞中，敲除HMGA1可明显抑制肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭、肿瘤细胞的移植瘤形成及体内转移［12］。同时，HMGA1是原癌基因HRAS的下游信号分子。Cleynent等［13］将原癌基因Ha-RASLeu61表达载体稳定转染人胚胎肾HEK293细胞株后，qRT-PCR及Western Blot检测到二者的表达均明显升高。应用荧光素酶报告基因分析发现，在HMGA1启动子区域有三个与HRAS致癌作用相关的调节区域，包括两个近端区域（PRR1；－78／－24 bp），（PRR2；＋222／＋335 bp）及一个远端区域（DRR；－1745／－1161 bp），而将含这些区域的 pIC（－1745／＋265）载体及 HRAS 共转染到HEK293细胞后，HMGA1启动子活性增加了15～20倍。在本实验中，HMGA1在侵袭性、非侵袭性垂体腺瘤中的mRNA 表达分别是 1.12±0.20，0.52± 0.19（P＜0.05），在组织中阳性表达率分别为20／28和14／32（P＜0.05），免疫印迹条带灰度值分别是 0.98±0.12，0.66±0.09（P＜0.05）。这些结果提示HMGA1在侵袭性组织中的表达量高于非侵袭性组织。另有研究发现，高水平表达的HMGA1与低水平表达的microRNA-296与前列腺癌的分级分期呈正相关，microRNA-296可促进HMGA1的降解及抑制其转录。给以外源性的microRNA-296可减少其表达水平，从而抑制前列腺癌的增殖及侵袭［14］。在我们前期基因芯片筛选侵袭性及非侵袭性垂体腺瘤差异表达的microRNA基础上［15］，应用microRNA靶基因预测软件Tartget Scan预测可调控 HMGA1的 microRNA，发现 microRNA-138不仅与垂体腺瘤侵袭性密切相关而且其机制可能与对HMGA1的负调控作用相关，但仍需后续实验进一步证实。

综上所述，本实验研究结果提示HRAS、HMGA1的高表达与垂体腺瘤的侵袭性生长密切相关。本课题组前期已检测到一些与垂体腺瘤侵袭性行为相关的靶基因，同时应用基因芯片完成了对侵袭性垂体腺瘤及非侵袭性垂体腺瘤中microRNA表达差异谱的筛选。在后期的实验中，我们将从分子水平更深入研究microRNA对前期研究的靶基因的调控与垂体腺瘤侵袭性的关系，以期探讨促进侵袭性垂体腺瘤发生的分子信号的相互作用机制，期待为垂体腺瘤找到有效的干预治疗靶点。

［1］Yong HY，Hwang JS，Son H，et al.Identification of H-Rasspecific motif for the activation of invasive signaling program in human breast epithelial cells［J］.Neoplasia，2011，13（2）：98－107.

［2］Erasca E，Rnstighi A，Malngnamera R，et al.HMGA1 inhibits the function of p53 family members in thyroid cancer cells［J］.Cancer Res，2006，66（6）：2980－2989.

［3］Wilson CB.A decade of pituitary microsurgery： The Herbert o-Livercrona lecture［J］.Neurosurgery，1984，61（5）：814－833.

［4］Gupta S，Ramjaun AR，Haiko P，et al.Binding of RAS to phosph-oinositide 3-kinase p110alpha is required for RAS-driven tumorigenesis in mice［J］.Cell，2007，129（5）：957－968.

［5］Kim IY，Jeong SJ，Kim ES，et al.Type I collagen-induced pro-MMP-2 activation is differentially regulated by H-RAS and N-RAS in human breast epithelial cells［J］. J Biochemi Mol Biol，2007，40（5）：825－831.

［6］Lee KW，Kim MS，Kang NJ，et al.H-RAS selectively upregulates MMP-9 and COX-2 through activation of ERK1／2 and NF-KB：An implication for invasive phenotype in rat liver epithelial cells［J］.International Journal of Cancer，2006，119（8）：1767－1775.

［7］霍钢，田加坤，唐文渊，等.MMP-2及 CD147在侵袭性垂体腺瘤中的表达及其相互关系的研究［J］.中国神经精神疾病杂志，2005，31（3）：168－171.

［8］李九州，霍钢，郑履平，等.MMP-9、HPA及CD34在侵袭性垂体腺瘤中表达的研究［J］.中国神经精神疾病杂志，2007，33（7）：404－407.

［9］冯清林，霍钢，唐茂源，等.侵袭性垂体腺瘤中自噬相关基因Beclin1和MAPLC3的表达［J］.中国神经精神疾病杂志，2010，36（8）：476－479.

［10］Yoo BH，Wu X，Li Y，et al.Oncogenic RAS-induced downregulation of autophagy mediator beclin-1 is required for malignant transformation of intestinal epithelial cells［J］.J Biol Chem，2010，285（8）：5438－5449.

［11］张鑫，朱明光，袁红艳，等.HMGA1基因转染诱导NIH3T3细胞恶性转化实验研究［J］.中国免疫学杂志，2008，24（5）：390－393.

［12］Belton A，Gabrovsky A，Bae YK，et al.HMGA1 induces intestinal polyposis in transgenic mice and drives tumor progression and stem cell propertiesin colon cancer cells［J］.PLoS ONE，2012，7（1）：e30034.

［13］Cleynen I，Huysmans C，Sasazuki T，et al.Transcriptional control of the human high mobility group A1 gene：basal and oncogenic RAS-regulated expression［J］.Cancer Res，2007，67（10）：4620－4629.

［14］Wei JJ，Wu XY，Peng Y，et al.Regulation of HMGA1 expression by microRNA-296 affects prostate cancer growth and invasion ［J］.Clin Cancer Res，2011，17（6）：1297－1305.

［15］吴留洋，霍钢，杜安东，等.miRNA在侵袭性垂体腺瘤中表达的初步研究［J］.中国神经精神疾病杂志，2011，37（12）：752－755.