难治性抑郁症治疗前后外周血白细胞Bcl-2 mRNA表达研究☆

抑郁症是一种高患病率、高复发率、高致残率、高自杀率以及高负担的常见精神障碍。尽管经过正规的治疗，大部分患者的病情能得到有效缓解，但仍有约20％～30％的患者成为难治性抑郁症［1］。神经营养假说认为抑郁症可能存在神经细胞的凋亡现象［2，3］，而外周血 B 细胞淋巴瘤白血病－2 基因（B-cell lymphoma Leukemia-2，Bcl-2）Bcl-2 具有抑制凋亡的作用［4］。研究［5－7］显示抑郁症患者和应激动物模型的神经细胞和外周血淋巴细胞的Bcl-2基因表达下降，而经抗抑郁药治疗后，Bcl-2基因表达上升。那么难治性抑郁症是否在神经凋亡的程度上有别于非难治性抑郁症呢？尽管，已有一些研究［8－10］发现难治性抑郁症的某些大脑环路功能和某些脑区的细微结构较非难治性抑郁症变化更为明显。但有关难治性抑郁症Bcl-2基因表达的变化尚未见报道。本研究比较了难治性抑郁症、非难治性抑郁症和正常对照组之间外周血Bcl-2基因的表达水平，并观察抗抑郁治疗后Bcl-2基因表达的变化，以探讨Bcl-2基因在难治性抑郁症可能的发病机制和治疗中的变化。

1 对象和方法

1.1 研究对象 为2006年1月1日至2007年12月31日就诊于上海市精神卫生中心、上海市心理咨询中心门诊及住院的抑郁症患者，包括治疗前和治疗后。入组标准：①符合国际疾病分类-10（international Classification of diseases，ICD-10）“抑郁发作”诊断标准；②年龄18～65岁，男女不限；③17项汉密尔顿抑郁量表（Hamilton Depression Scale，HAMD17）评分≥17分；④初中及以上文化程度；⑤有足够的视听水平以完成研究必需的检查。排除标准：①目前为“抑郁发作”的双相障碍患者；②妊娠或哺乳期妇女，或计划妊娠者；③患有下列严重疾病：窄角型青光眼，癫痫，心肌梗塞，不稳定性心绞痛，充血性心衰，严重肝硬化，急慢性肾功能衰竭，严重糖尿病，再生障碍性贫血，中重度营养不良及其它严重神经、心、肝、肾、内分泌、血液系统等躯体疾病或可能干扰试验评估的疾病；④物质依赖、器质性精神障碍及精神发育迟滞者；⑤曾出现严重过敏反应者。

其中治疗前是指抑郁症急性发作期，未经正规抗抑郁治疗；治疗后是指治疗前患者入组后接受正规抗抑郁治疗（包括SSRI类、SNRI类或NaSSA类）治疗满8周者；难治性抑郁症是指抑郁症患者入组前已经过至少2种作用机制不同的抗抑郁药物足量（如米帕明≥150 mg／d）、足疗程（6周）治疗效果不佳（HAMD减分率≤50％）。

共收集抑郁症患者49例，男23例，女26例，平均年龄（45.06±13.01）岁。其中难治性抑郁症组23例，平均年龄（43.22±12.78）岁；非难治性抑郁症组 26 例，平均年龄（46.69±13.24）岁。

健康对照组：来自上海市精神卫生中心职工、研究生、进修医师及上海市静安区精神卫生中心及上海消防局职工。年龄18～65岁，汉族；HAMD17评分＜7分；排除既往及访谈时存在的各类精神疾病、脑器质性疾病、较严重的心脑血管疾病及肝肾功能等重大疾病史、物质滥用等及精神疾病家族史。

健康对照组51例，男25例，女26例，平均年龄（39.19±12.54）岁。各组之间性别和年龄上的差异无统计学意义（χ2＝0.486，P＞0.05；F ＝2.978，P＞0.05）。

该研究通过上海交通大学医学院附属精神卫生中心伦理委员会批准，所有受试者均已签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 临床一般资料收集和评估 对所有入组患

者进行一般资料（包括年龄、性别、文化程度、职业、精神疾病家族史等）和发病情况（发病年龄、病程和复发次数等）调查，采用HAMD17评估抑郁发作的严重程度及症状特点以收集基线水平的数据。并在入组后半年到一年随访，以剔除双相障碍。对51例健康对照进行一般资料调查，采用一般心理健康调查问卷（GHQ）、抑郁问卷（CES-D）调查排除抑郁症等精神疾病及严重躯体疾病，并收集一般资料包括年龄、性别、文化程度等。

1.2.2 cDNA的提取和转录 提取外周血 1 mL，EDTA抗凝，离心分离白细胞，TrizoL处理白细胞，氯仿／异戊醇抽提RNA，并用异戊醇离心沉淀得到RNA，75％乙醇洗涤后溶于40 μL DEPC水中。用Dnase I酶处理RNA，然后用氯仿、异戊醇、70％乙醇再次抽提RNA，并溶解于30 μL Rnase free水中。使用逆转录试剂盒（Qiagen，Chatsworth CA）和随机引物合成cDNA备用。

1.2.3 TaqMan荧光实时定量 PCR 采用 TaqMan MGB探针法在384孔ABI Prism 7900序列检测系统（Applied Biosystems，CA，USA）上进行荧光实时定量PCR扩增，分析目的基因的表达水平。以管家基因GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，购于 Applied Biosystems，CA，USA）作为内对照基因来标化目的基因的表达水平。将51例正常对照的cDNA混合作为标准品，在每个384孔反应板上均测定此标准品的目的基因和内对照基因的表达曲线以作为待测样本的基因表达量的参照。每个待测样本的目的基因和内对照GAPDH基因均重复3次。同时分别设立3个阴性对照孔。TaqMan荧光实时定量PCR扩增的反应体系均根据美国ABI公司提供的推荐方案。

1.2.4 比较 Ct值法 采用比较 Ct值的方法［11（Comparative Ct Method）进行相对定量，用SDS version 2.0软件（Applied Biosystems）进行数据采集。荧光定量PCR的结果以Ct值显示，Ct值为每个反应管内的荧光信号到达设定的预值时所经历］的循环数，Ct值越大，表达量越低。平均△Ct为样本目标基因平均Ct值减去内对照GAPDH平均Ct值。用健康对照组的平均ΔCt值为标准（calibrator）计算出每个患者组的 2－ΔΔCt（每个患者组的 ΔΔCt＝每个患者组的平均ΔCt-正常组平均ΔCt），来计算表达差异的倍数。以每个样本2－ΔΔCt代表目的基因的表达水平。

1.3 统计学方法 使用SPSS 16.0进行统计分析。通过t检验和方差分析比较组间基因表达差异的显著性水平。3组样本的性别和年龄的比较采用卡方和方差分析；三组样本的Bcl-2基因的表达量比较采用方差分析，并采用Games Howel进行两两比较；治疗前后的Bcl-2基因表达量的比较采用配对t检验；与临床特征的相关性采用pearson相关分析；检验水准 α ＝0.05，双侧检验。

2 结果

2.1 各组外周血白细胞Bcl-2基因的表达量 治疗前抑郁症组患者外周血白细胞Bcl-2基因表达量低于正常对照组，差异具有统计学差异（t＝－4.438，P＜0.01）。TRD 组、非 TRD 组和正常对照组外周血白细胞Bcl-2基因表达水平的差异有统计学意义（F＝11.468，P＜0.001），两个患者亚组均低于对照组，TRD组又低于非TRD组，见表1。

2.2 各组治疗后外周血白细胞Bcl-2基因的表达量 抑郁症患者组治疗后Bcl-2基因表达量较治疗前上升（t＝－2.040，P ＝0.047）。分组分析显示，TRD组治疗后Bcl-2基因表达量较治疗前上升（t＝－2.090，P ＝0.048），而非难治性抑郁症组治疗后基因表达量上升无统计学差异（t＝－1.116，P＝0.275）。详见表 1。

2.3 各临床指标与Bcl-2基因表达量的相关性分析

抑郁症组患者经抗抑郁治疗后，HAMD17量表平均减分率为71.45％，其中TRD组HAMD17量表平均减分率为62.23％，非TRD组HAMD量表平均减分率为82.97％。抑郁症组治疗前Bcl-2基因表达量与 HAMD17（r＝－0.174，P＝0.310）、HAMA 总分（r＝－0.047，P＝0.781）、起病年龄（r＝0.177，P ＝0.302）、病程（r＝－0.147，P ＝0.515）无显著相关性。治疗前后Bcl-2基因表达量的变化与HAMD17总分减分率之间无显著相关性（r＝0.072，P ＝0.677）。

表1 抑郁症组与对照组Bcl-2表达量

3 讨论

神经营养假说认为神经网络的可塑性改变可能是抑郁症病因机制之一，抗抑郁治疗通过调控与神经可塑性相关的信号转导和基因而起到抗抑郁的疗效。应激会导致与认知和情绪相关的某些脑区的神经细胞出现萎缩，虽然神经细胞具有可塑性和神经再生功能，但慢性刺激或严重的刺激将可能导致细胞凋亡。

Bcl-2基因是最早从滤泡性B细胞淋巴瘤细胞染色体上发现的，能在各种不同的正常组织和细胞的激活过程中表达。Bcl-2基因及其表达蛋白的作用在于普遍保护细胞免受多种刺激诱导的凋亡，阻止不同刺激引起的凋亡，维持细胞存活，称其为凋亡抑制因子。因此，Bcl-2的抗凋亡作用很可能是凋亡过程的最后共同途径。除了抗凋亡作用，Bcl-2因具有加强细胞内钙通道活性、激活CREB-ERK通路等作用而促进神经突触和轴突的形成和再生［4］。

有关应激动物和抑郁症患者Bcl-2表达研究中，大部分研究［4－6］结果显示抑郁症动物模型应激动物的大脑某些区域，如海马、边缘叶，Bcl-2基因表达和蛋白表达量下降，但也有部分研究［12，13］得出截然相反的结果，这些研究发现实验动物应激后海马部位Bcl-2含量上升，抑郁症患者外周白细胞Bcl-2蛋白含量上升。Bravo等［13］认为应激后Bcl-2表达量上升，可能与慢性应激后激活了抗凋亡的机制有关。由此说明，应激后或抑郁症患者Bcl-2表达量出现不升反降的现象，提示抗凋亡功能的抑制。本研究结果提示抑郁症患者外周血Bcl-2基因表达水平下降，而难治性抑郁症患者下降更为明显，说明抑郁症患者外周血淋巴细胞抗凋亡能力下降、神经突触形成和再生能力的下降，且难治性抑郁症患者的抗凋亡能力和神经再生能力下降更为明显。有关难治性抑郁症具有更突出的神经系统损伤，同样被其他的研究验证，如一些研究［8，9，14］发现难治性抑郁症患者，大脑的某些环路功能、海马部位细微结构变化等更为明显，甚至某些基因的的多态性可能成为预测抑郁症患者是否难治的早期预测指标。

有关抗抑郁治疗对于Bcl-2的作用，大部分研究［6，15，16］结果显示，抗抑郁药（如吗氯贝胺、丙咪嗪、文拉法辛、氟西汀、西酞普兰等）均能提高Bcl-2的表达量。本研究中，抑郁症患者经过抗抑郁治疗8周后，其外周血白细胞Bcl-2基因表达量上升。虽然，本研究和国内外多项研究都证实抗抑郁药物的治疗对Bcl-2的表达有上调作用，但这种作用的实际临床意义却并不明确。有研究发现抗抑郁药治疗后，其海马Bcl-2蛋白的上升与BDNF的上升呈平行关系，并受ERK1／2信号通路的磷酸化调节。因此，本研究发现抗抑郁治疗后患者Bcl-2表达上升，间接说明了临床上常用的抗抑郁药可能具有激活和改善抗凋亡能力、促进神经再生的作用，并提示抗凋亡和促进神经再生可能是抗抑郁作用的机制之一。

然而，本研究中根据患者是否难治进一步分组分析后，发现只有难治性抑郁症患者经抗抑郁治疗后Bcl-2表达上升明显，非难治性抑郁症治疗后Bcl-2表达上升不明显。说明，难治性抑郁症患者在急性期治疗期间，其抗凋亡能力已经得到一定修复，而非难治性抑郁症患者在治疗初期抗凋亡能力修复不明显。回顾本研究入组的难治性抑郁症和非难治性抑郁症患者的治疗效果，其HAMD17减分率分别为 62.23％和 82.97％，即大部分难治性患者经本次治疗得到明显的改善，但总体疗效低于非难治性抑郁症患者。说明外周血Bcl-2基因表达水平的上升并不与HAMD17减分率呈平行关系。

本研究中，非难治性抑郁症患者虽经抗抑郁治疗后，抑郁症状得到明显改善，但神经系统的修复尚需更长的时间，这可能正是抑郁症的维持和巩固治疗的神经病理机制之一。而本研究中难治性抑郁症患者经8周抗抑郁治疗后，Bcl-2基因表达上升较非难治组明显。在Reus等研究［16］中发现氟西汀和奥氮平联合治疗比单一药物治疗改善中枢神经系统细胞活性更为显著。因此，笔者认为本研究中难治性抑郁症患者急性期治疗后外周血Bcl-2基因表达量上升明显，这可能是本研究中难治性抑郁症患者在药物选择上多集中于双通道抗抑郁药或多药联合治疗，可能更快的促进神经系统再生和修复的功能。

此外，在本课题组既往的研究［18］中，同样发现了亚综合征抑郁的患者外周血Bcl-2基因表达下降，说明抑郁患者在疾病早期就存在抗凋亡的抑制。同样，本研究中发现Bcl-2基因的表达水平与临床特征（包括病程、发病年龄、HAMD17总分、HAMA总分及治疗前后HAMD17减分率等）进行相关分析，发现Bcl-2基因的表达水平与这些临床特征无显著相关性。说明外周血Bcl-2基因表达量与疾病的长短、严重程度等可能不存在直接的关系，抑郁患者Bcl-2基因表达量早在疾病早期或疾病轻度状态时就已经出现。从本研究结果来看，外周血Bcl-2基因表达量的变化与HAMD17减分率并无明显相关性，可能是抗抑郁治疗后外周血相关生物学指标的变化存在时间滞后性。在一项研究注射盐酸氯胺酮快速治疗难治性抑郁症的研究中［18］，发现盐酸氯胺酮快速治疗难治性抑郁症后，抑郁症状在短时间内得到了改善，但外周血BDNF的量并未见相应的上升。

本研究探究的是外周血Bcl-2基因的表达水平，虽然不能完全代表中枢Bcl-2基因表达的真正水平，但在中枢组织取材困难的形势下，外周血基因表达水平的变化在某种程度上与中枢相关基因表达呈正相关。此外，较之采用脑组织的动物模型和尸脑组织研究，外周血的研究更能体现患者活体的真实状况，并且更易于研究成果向临床应用转化。

本研究在设计上，尚存在一些不足和需要改进之处。首先，本研究入组病例在治疗药物的选择上采用开放式选择，对临床药物选择上并未做严格的规定，而只是相对统一在SSRI和SNRI类药物的治疗，不利于进一步分析具体药物与Bcl-2基因表达的关系。其次，本研究样本量较少，很难从临床特征和治疗药物上做更多的分型和分析。第三，药物治疗激活抗凋亡机制的过程可能需要更长的时间，而本研究中患者组治疗观察时间仅为6～8周。在将来的研究中，如果能在以上的不足进行弥补，将有助于更好地探究外周血白细胞Bcl-2基因表达水平与抑郁症的关系。总之，本研究结果发现难治性抑郁症患者外周血Bcl-2基因表达量低于非难治性抑郁症和正常人，难治性抑郁症经急性期抗抑郁治疗后能提高Bcl-2基因的表达水平。说明难治性抑郁症患者外周血淋巴细胞抗凋亡能力严重受损，而抗抑郁治疗能改善抗凋亡的功能。

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