吉西他滨联合奥沙利铂对人胆管癌裸鼠移植瘤模型的药效实验研究

胡晓莉， 谭清和， 王建红， 苏小琴， 季进锋

胆管癌是一种起源于胆管上皮的恶性肿瘤，由于胆管癌的病因和发病机制不明，手术切除率低，预后差，最近研究表明欧美国家胆管癌5年生存率仍低于5%［1］。早期诊断是提高切除率的关键，而如何改善放化疗等综合治疗的疗效是决定患者能否长期生存的重要方面［2］。临床研究已证实吉西他滨对胰腺癌具有一定的治疗作用［3］，而奥沙利铂对消化道肿瘤亦有一定的疗效，两者联合应用能否对胆管癌有一定疗效值得探讨，故本实验利用胆管癌细胞株建立了人胆管癌移植瘤模型，观察吉西他滨联合奥沙利铂应用对胆管癌移植瘤的抑制作用，为两药在临床上的联合应用提供初步依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

52只4～6周裸鼠，18～22 g，雌雄兼用，购自南京大学模式动物研究所。人胆管癌细胞株(QBC939)购自武汉生物制品研究所细胞库。实验药品和试剂:吉西他滨，200 mg/瓶，Lilly公司。奥沙利铂，50 mg/瓶，杭州赛诺菲制药有限公司。RPMI 1640培养液，Gibco公司。小牛血清，杭州四季青生物公司。实验仪器:游标卡尺，北京量器具厂。

1.2 方法

1.2.1 人胆管癌细胞(QBC939)裸鼠模型的建立

(1)荷瘤鼠的接种:将QBC939人胆管癌细胞株置于含10%小牛血清的RPMI 1640培养液中培养，传代2～3周，离心后制成1 mL含107～108个细胞/mL的悬液(细胞计数板计数)。每只裸鼠左下肢皮下注射0.2 mL的瘤细胞悬液，共注射3只。(2)裸鼠移植瘤模型的建立:约1周后荷瘤鼠左下肢均出现瘤块，待肿瘤长至直径约0.8～1.0 cm时，处死其中1只，在超净台内剥离出肿瘤，稍冲洗后，置于含10%小牛血清的RPMI 1640培养液中，眼科剪充分剪碎，制成小瘤块(约1 mm3)。49只裸鼠每只右下肢皮下种植小瘤块，约2～3块，3-0可吸收缝线缝合。

1.2.2 实验分组 49只荷瘤裸鼠肿块直径均 ＞0.8 cm时予以药物实验，随机平均分成为7组，每组7只。(1)空白对照组:每只裸鼠经腹腔注射0.3 mL生理盐水。(2)A组(腹腔注射单倍剂量奥沙利铂组):每只裸鼠腹腔注射0.3 mL奥沙利铂(剂量:1.125 mg/kg)。(3)B组(腹腔注射单倍剂量吉西他滨组):每只裸鼠腹腔注射0.3 mL吉西他滨(剂量:50 mg/kg)。(4)A+B组(腹腔联合注射单倍剂量奥沙利铂和吉西他滨组):第1天每只裸鼠腹腔注射0.3 mL 奥沙利铂(剂量:1.125 mg/kg)，第2 天每只裸鼠腹腔注射0.3 mL吉西他滨(剂量:50 mg/kg)。(5)2A+B(腹腔联合注射双倍剂量奥沙利铂和吉西他滨组):第1天每只裸鼠腹腔注射0.3 mL奥沙利铂(剂量:2.25 mg/kg)，余同第(4)组。(6)A+2B组(腹腔联合注射单倍剂量奥沙利铂和双倍剂量吉西他滨组):第1天同第(4)组，第2天每只裸鼠腹腔注射0.3 mL吉西他滨(剂量:100 mg/kg)。(7)2A+2B组(腹腔联合注射双倍剂量奥沙利铂及吉西他滨组)实验过程同(4)组，奥沙利铂剂量为2.25 mg/kg，吉西他滨剂量为100 mg/kg。

1.2.3 药效评估 每周2次测量肿瘤的长、短径，计算体积。肿瘤体积=1/2×长径×短径2。相对肿瘤体积(RTV)=Vt/V0(其中Vt为每一次测量时的肿瘤体积，V0为给药时的肿瘤体积)。药物的抗肿瘤评价指标为相对肿瘤增殖率=(治疗组RTV/对照组RTV)×100%。疗效评价标准:相对肿瘤增殖率≤60%为有效，＞60%则为无效。

1.2.4 形态学观察 治疗后第24天处死裸鼠，取出移植瘤标本，用福尔马林溶液固定，石蜡包埋，HE染色，显微镜下观察。

1.2.5 肿瘤标志物检测 于治疗后第24天采取对照组和治疗组裸鼠血样本，采用放射免疫法测定样本的血清CEA、CA199、CA50含量。

1.2.6 统计方法 采用SAS 9.1.3统计软件绘制肿瘤生长曲线，统计方法为t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 荷瘤鼠的一般情况

荷瘤后裸鼠无特殊异状，接种后1周局部组织水肿消失，右下肢缝合线结脱落，所有裸鼠右下肢均出现包块，成瘤率100%，平均潜伏期14天。当肿块直径均＞0.8 cm时予以药物实验，实验第1天予注射奥沙利铂，空白对照组注射生理盐水，第2天注射吉西他滨。药物注射区无溃疡发生，实验期间肿块无溃疡发生，无裸鼠死亡。实验第24天时处死裸鼠，行病理、细胞学检查。

2.2 相对肿瘤增殖率的比较

给药后第 2、5、8、11、14、17、20、24 天测量肿瘤体积，计算相对肿瘤增殖率，各组裸鼠移植瘤相对肿瘤增殖率见表1，相对肿瘤增殖率曲线见图1。由数据可知，单用奥沙利铂时，刚开始抑瘤效果差，但随着时间的推移，抑瘤效果增强，到 d24时，为39.78%;而单用吉西他滨开始抑瘤效果好，后又较奥沙利铂差，提示两药的抑瘤作用发挥于不同的时间段，两药联用可发挥互补作用。两药联用后，抑瘤效果较为稳定，变化趋势不大，两药双倍剂量联用抑瘤效果明显好于单倍剂量联用，可以推断，两药联用时抑瘤作用的发挥呈现一定的剂量依赖性。在各时间点，A+2B组、2A+B组的相对肿瘤增殖率均低于A+B组，2A+2B组低于2A+B组，由此提示奥沙利铂、吉西他滨联用时提高奥沙利铂或吉西他滨的剂量，均可提高抑瘤效果。

表1 裸鼠移植瘤给药后的相对肿瘤增殖率

图1 各组裸鼠移植瘤相对肿瘤增殖率曲线图

2.3 形态学观察

2.3.1 对照组 大体观察:移植瘤表面凹凸不平，外观呈粉红色，切面中心为灰白色，瘤组织质脆易碎，中心有坏死。其他组织和脏器未见明显转移灶。光镜检查(见图2):移植瘤组织包膜较完整，体积大，中心有坏死灶;细胞大小、形态不规则，分化程度低，有一个或多个大而不规则的圆形或椭圆形核，细胞质相对较少，可见分裂细胞。

2.3.2 实验组 大体观察:移植瘤体积较对照组减小，瘤体中心坏死区域较大。光镜检查(见图3):瘤细胞团块体积减少，瘤组织出现大片坏死及退变，间质淋巴细胞浸润增多。

图2 空白对照组荷瘤鼠的肿瘤病理图(×100)

图3 2A+2B组荷瘤鼠的肿瘤病理图(×100)

2.4 肿瘤标志物检测

分别检测对照组与2A+2B组的肿瘤标志物CEA、CA199、CA50血清含量，具体数值见表2，经 t检验，两组差异均有统计学意义(均P＜0.05)。

表2 对照组与2A+2B组的肿瘤标志物检测情况

3 讨论

早期胆管癌多无明显的临床症状，患者多因黄疸就诊，手术切除率低，仅为10% ～40%［4］。大多数不能手术切除的患者只能接受内引流、金属内支架、经皮肝穿刺胆道引流等姑息性治疗，虽然可以暂时缓解梗阻性黄疸、改善肝功能，但胆管的通畅只是暂时的，不能根治肿瘤。目前在胆管癌领域仍缺乏特效的化疗药物和方案，胆管癌患者的预后极差，因此，研究对胆管癌有效的化疗药物和方案迫在眉睫。

奥沙利铂(oxaliplatin)为二氨环己烷的铂类化合物。作用机制以DNA为靶作用部位，铂原子与DNA链形成交联，阻断其复制和转录，由此杀灭肿瘤细胞，目前临床上也已公认奥沙利铂对消化道肿瘤有效［5］。吉西他滨(gemcitabine)是脱氧胞嘧啶核苷的类似物，为核苷酸还原酶抑制剂。在细胞内通过脱氧胞嘧啶核苷激酶磷酸化，转化成具有活性的二磷酸(dFdCDP)及三磷酸核苷(dFdCTP)。dFdCDP可抑制核苷酸还原酶，致使细胞内合成DNA所需的dCTP产生减少，而dFdCTP能与dCTP竞争结合DNA，两者共同使DNA链延长受阻，引发细胞凋亡。已有体外实验发现，吉西他滨可以作用于胆管癌细胞，延缓胆管癌细胞的生长［6］。本实验以胆管癌裸鼠移植瘤模型为平台，研究奥沙利铂与吉西他滨联用对胆管癌的治疗作用。结果显示，单独应用奥沙利铂与吉西他滨第24天相对肿瘤增殖率分别为39.78%和45.73%，根据抗肿瘤药物药效评价标准，奥沙利铂与吉西他滨均对该胆管癌裸鼠模型具有抑瘤作用。当两药联用时，抑瘤效果变化趋势不大，且当吉西他滨的使用剂量达到100 mg/kg时，相对肿瘤增殖率明显降低，说明高剂量吉西他滨具有更强的抑瘤效果。通过病理切片观察以及肿瘤标志物的检测，显示奥沙利铂与吉西他滨联合应用对胆管癌有显著的抑制作用，此与Andre等［7］的研究结果相一致。

吉西他滨与奥沙利铂的联合化疗对胆管癌具有治疗作用，为临床胆管癌的化疗提供了一个新的选择和方向，但目前尚在动物实验阶段，最终结果还需等待临床试验的开展。

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