黔北麻羊ＲＥＲＧＬ基因ｃＤＮＡ克隆与生物信息学分析

蔡惠芬 陈志 罗卫星 等

摘要：选择与羊同源性较高的牛ＲＥＲＧＬ基因组序列设计特异性引物，提取黔北麻羊脾脏总ＲＮＡ，通过ＲＴ-ＰＣＲ技术对ＲＥＲＧＬ基因进行克隆测序及序列分析。结果表明，成功克隆了黔北麻羊ＲＥＲＧＬ基因，其ｃＤＮＡ序列６４６ ｂｐ，ＧｅｎＢａｎｋ登录号ＪＮ ６７１９１９，编码２０５个氨基酸。生物信息学分析表明，黔北麻羊ＲＥＲＧＬ基因蛋白二级结构α－螺旋占４０．６8％，延伸链占１６．１８％，无规则卷曲占４３．１４％；没有跨膜螺旋结构域且没有糖基化位点。

关键词：黔北麻羊；ＲＥＲＧＬ基因；克隆；生物信息学分析

中图分类号：Ｓ８２７；Ｑ８１１．４文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）15－3362-04

cDNA Sequence Cloning of RERGL Gene of Qianbei Ma Goat and Bioinformatics Analysis

ＣＡＩ Ｈｕｉ-ｆｅｎ，ＣＨＥＮ Ｚｈｉ，ＬＵＯ Ｗｅｉ-ｘｉｎｇ，ＬＩＵ Ｒｕｏ-ｙｕ，ＺＨＡＮＧ Ｙｉ-ｙｕ，ＳＨＩ Ｚｈａｏ-ｙｉｎｇ

（Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ａｎｄ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｌａｔｅａｕ Ｍｏｕｎｔａｉｎｏｕｓ Ｒｅｇｉｏｎ／Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ ５５００２５， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｒｉｍｅｒｓ ｏｆ ｇｏａｔ ＲＥＲＧＬ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｈｏｍｏｌｏｇｉｃ ｇｅｎｅ ｏｆ ｏｘ． Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｏｆ Ｑｉａｎｂｅｉ Ｍａ ｇｏａｔ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｐｌｅｅｎ． Ｔｈｅ ｃＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ＲＥＲＧＬ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣＲ （ＲＴ－ＰＣＲ） ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＲＥＲＧＬ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｑｉａｎｂｅｉ Ｍａ ｇｏａｔ ｗａｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｃｌｏｎｅｄ． Ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｅｎｇｔｈ ｗａｓ ６４６ ｂｐ， ｅｎｃｏｄｉｎｇ ２０５ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ； ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ｗａｓ ＪＮ ６７１９１９． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ the ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＲＥＲＧＬ ｗａｓ ４０．６8％ α－ｈｅｌｉｘ ＋１６．１８％ ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ ｃｈａｉｎ＋４３．１４％ ｒａｎｄｏｍ ｃｏｉｌ． Ｎｏ ｔｒａｎｓ－ｍｅｍｂｒａｎｅ ｈｅｌｉｘ ｄｏｍａｉｎ ａｎｄ Ｏ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｑｉａｎｂｅｉ Ｍａ ｇｏａｔ； ＲＥＲＧＬ ｇｅｎｅ； ｃｌｏｎｅ； ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ

ＲＥＲＧＬ基因属于Ｒａｓ超家族基因。Ｒａｓ超家族是一类重要的功能蛋白。它们介导生长因子、细胞因子和多种细胞外信号的通路，对细胞生长、分化、存活、增殖等多种功能的调节发挥重要作用［１］。Ｒａｓ超家族在细胞信号转导中可作为信号转换器或分子开关，它们通过与ＧＴＰ结合（激活态）和ＧＤＰ结合（失活态）的转换导致信号的转导或终止［２］。ＲＥＲＧＬ与部分Ｒａｓ超家族成员的同源性可达４０％～５０％。其蛋白与ＲＥＲＧ（Ｒａｓ－ｒｅｌａｔｅｄ ａｎｄ ｅｓｔｒｏｇｅｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）蛋白功能高度相似。

黔北麻羊是贵州省三大优良山羊品种之一。其历史悠久，具有耐粗饲、繁殖率高、产肉性能良好、膻味轻、肉鲜美可口、板皮品质优良等优点，为当地群众所喜养［３］。罗卫星等［４］对黔北麻羊的肉用性能和肉质特征进行研究，表明黔北麻羊肉用性能和肉质性质良好，具有很好的开发价值。在分子水平上，关于黔北麻羊ＲＥＲＧＬ基因的研究国内外尚未见报道。本研究以黔北麻羊为研究对象，通过分子克隆技术对ＲＥＲＧＬ基因ｃＤＮＡ进行克隆后测序，并对结果进行生物信息学分析，以期为进一步开展黔北麻羊ＲＥＲＧＬ基因的表达调控以及与生长性状相关分析研究提供一定的理论基础。

１材料与方法

１．１材料

从贵州省习水县采集成年黔北麻羊的脾脏，液氮中保存备用。

１．２试剂和载体

ＲＮＡ提取试剂盒（Ｔｒｉｚｏｌ）购自ＭＢＩ公司；ＬＢ培养基；氨苄青霉素（Ａｍｐ）（１００ ｇ／Ｌ）；１０×ＴＢＥ缓冲液；ＤＥＰＣ和琼脂糖购自ＳＩＧＭＡ公司；ｐＭＤ１８-Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ、反转录试剂盒（ＤＲＲ０３７Ａ）、Ｔａｑ酶和ｄＮＴＰ购自大连ＴａＫａＲａ公司；菌种ＴＧ１、ＤＬ ２０００ Ｍａｒｋｅｒ、去离子甲酰胺、引物及其他常用试剂均购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

１．３提取ＲＮＡ前的准备工作

玻璃制品用０．１ Ｍ的ＮａＯＨ浸泡过夜，用自来水反复冲洗，再用去离子水冲洗２遍，１８０ ℃烘烤６ ｈ；研钵、电泳槽等用０．１％的ＤＥＰＣ水冲洗浸泡，由于未灭活的ＤＥＰＣ对ＰＣＲ反应有影响，可用０．５ ％的ＳＤＳ处理；Ｔｉｐ头、ＥＰ管用０．１ ％的ＤＥＰＣ水浸泡过夜，高压灭菌使ＤＥＰＣ失活，烘干备用；提取前在超净工作台紫外照射１５ ｍｉｎ。

１．４总ＲＮＡ的提取及质量、浓度测定

根据ＲＮＡ提取试剂盒说明书用Ｔｒｉｚｏｌ法提取黔北麻羊脾脏总ＲＮＡ。用１％琼脂糖凝胶检测总ＲＮＡ的完整性，核酸蛋白测定仪测定浓度，－８０ ℃保存备用。

１．５引物设计

根据牛ＲＥＲＧＬ基因ｃＤＮＡ序列（ＮＭ＿００１１０５４７２．１）设计特异性引物ＲＥＲＧＬ-ＣＤＳ扩增羊ＲＥＲＧＬ基因的ＣＤＳ区，引物序列和退火温度见表１。

１．６ＲＴ-ＰＣＲ扩增

按照反转录试剂盒操作程序进行反转录。引物ＧＦＩ-１的ＰＣＲ扩增体系：反转录产物２．５ μＬ，１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ２＋ Ｐｌｕｓ）２ μＬ，ｄＮＴＰｓ（２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ）２．０ μＬ，上下游引物各１ μＬ，Ｔａｑ酶（５ Ｕ／μＬ）０．４ μＬ，加去离子水至总体积为２０ μＬ。扩增程序：９５ ℃预变性５ ｍｉｎ；９４ ℃变性３０ ｓ，５５ ℃退火４０ ｓ，７２ ℃延伸６０ ｓ，３５个循环；７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ，４ ℃ 保存，１％琼脂糖凝胶电泳检测。

１．７克隆及重组子筛选与鉴定

ＰＣＲ产物经电泳检测后，按ＤＮＡ胶回收试剂盒说明进行胶回收，用ｐＭＤｌ８-Ｔ载体连接ＰＣＲ纯化产物，常温过夜后转化连接产物到大肠杆菌ＴＧ１感受态细胞，均匀接种于含氨苄青霉素的ＬＢ琼脂糖平板中，３７ ℃培养１２～１６ ｈ，挑取单个菌落，接种于１ ｍＬ含１００ ｍｇ／Ｌ氨苄青霉素的ＬＢ液体培养基中，３７ ℃ ２２０ ｒ／ｍｉｎ培养１０ ｈ。取菌液做ＰＣＲ进行阳性重组子鉴定。阳性菌液送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。

１．８序列分析

测序结果用ＤＮＡＭＡＮ ４．０软件进行拼接，采用ＤＮＡＳｔａｒ、ＣＢＳ在线蛋白分析程序（ｈｔｔｐ：//ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ/ｓｅｒｖｉｃｅｓ/）和ＥｘＰＡＳｙ在线蛋白质分析软件（ｈｔｔｐ：//ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ/ｔｏｏｌｓ）进行生物信息学分析。

２结果与分析

２．１黔北麻羊脾脏总ＲＮＡ质量检测

ＲＮＡ模板的完整性是获得全长ｃＤＮＡ及ＲＴ-ＰＣＲ扩增成功的基础，用１％的琼脂糖凝胶电泳对所提取黔北麻羊脾脏组织总ＲＮＡ进行检测，结果见图１，可见总ＲＮＡ的２８ Ｓ和１８ Ｓ条带清晰，无降解。用核酸蛋白测定仪测定，其ＯＤ２６０／ＯＤ２８０均在１．８～２．０，表明所提取的总ＲＮＡ中蛋白质和其他杂质污染较少，纯度较高，符合反转录的要求。

２．２ＲＴ-ＰＣＲ的扩增结果及重组子鉴定

经ＲＴ-ＰＣＲ扩增，对产物用１％琼脂糖凝胶电泳检测，可见扩增片段与预期片段（６４６ ｂｐ）大小相符（图２）。将挑选好的单克隆菌落摇菌培养后，用ＰＣＲ法鉴定阳性重组子，可见扩增片段与预期片段大小相符，经克隆测序获得序列６４６ ｂｐ，初步的验证克隆成功。

２．３ＲＥＲＧＬ基因ｃＤＮＡ序列分析

利用ＤＮＡＭＡＮＮ ４．０对黔北麻羊ＲＥＲＧＬ基因测序结果进行拼接连接得到序列片段长度６４６ ｂｐ，与预期片段大小相符，包含了ＲＥＲＧＬ基因全编码区序列（ＣＤＳ）（包含起始密码子ＡＴＧ和终止密码子ＴＧＡ）并提交ＧｅｎＢａｎｋ，获得ＧｅｎＢａｎｋ登录号为ＪＮ ６７１９１９。其ｃＤＮＡ编码２０５个氨基酸。用ＤＮＡＭＡＮ ４．０对黔北麻羊ＲＥＲＧＬ基因分析可知，其碱基组成Ａ＋Ｔ＝５８．３７％，Ｃ＋Ｇ＝４１．６３％。

２．４ＲＥＲＧＬ基因蛋白的二级结构预测

分别应用ＥxＰＡＳy服务器上的ＳＯＰＭＡ［５］、ＧＯＲ［６］、ＨＮＮ［７］方法预测ＲＥＲＧＬ基因蛋白的二级结构。结果表明，３种方法对黔北麻羊ＲＥＲＧＬ基因蛋白的二级结构预测无显著性差异，均提示蛋白二级结构中α-螺旋占４０．６8％，延伸链占１６．１８％，无规则卷曲占４３．１４％，无β-转角（图３）。ＲＥＲＧＬ基因在脊椎动物之间是高度保守的一个基因，其氨基酸序列有家族特征［９，１０］。

２．５ＲＥＲＧＬ基因蛋白的跨膜螺旋特征

采用ＥｘＰＡＳｙ在线蛋白质分析软件（ｈｔｔｐ：//ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ）的ＴＭｐｒｅｄ程序对黔北麻羊ＲＥＲＧＬ基因蛋白的跨膜螺旋进行预测，结果见图４。按照跨膜拓扑学分析模型的分析结果，只有当分值大于５００时才被认为具有跨膜螺旋，预测显示黔北麻羊ＲＥＲＧＬ基因蛋白的氨基酸序列没有明显的跨膜螺旋。

２．６ＲＥＲＧＬ基因蛋白的糖基化位点预测

采用ＮｅｔＯＧｌｙｃ ３．１（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅ／ＮｅｔＯＧｌｙｃ／）预测黔北麻羊ＲＥＲＧＬ基因蛋白的糖基化位点，结果表明黔北麻羊ＲＥＲＧＬ基因蛋白没有糖基化位点（图５）。

３小结与讨论

３．１ＲＥＲＧＬ基因克隆

基因是细胞内染色体上具有遗传效应的ＤＮＡ分子片段，高等真核生物基因组由成千上万个基因组成。目前人、鸡、斑马鱼、大鼠、小鼠等动物的全基因组已被测定，并已分离鉴定出大量的功能结构基因，有一些基因已应用于动物育种［８-１０］。但是，仍还有大量的基因尚未被分离鉴定。ＲＥＲＧＬ基因编码蛋白是Ｒａｓ超家族一类重要的功能蛋白,在ＧｅｎＢａｎｋ数据库中，还未见羊的ＲＥＲＧＬ基因序列。本研究利用同为反刍动物的牛ＲＥＲＧＬ基因的ｍＲＮＡ序列设计１对特异性扩增引物，首次成功克隆出羊的ＲＥＲＧＬ基因序列，其片段大小为６４６ ｂｐ，ＧｅｎＢａｎｋ登录号为ＪＮ ６７１９１９，进一步说明采用序列的高度同源性设计ＰＣＲ引物进行基因克隆是可行的。

３．２黔北麻羊ＲＥＲＧＬ基因蛋白的结构与功能预测

蛋白质的生物学功能在很大程度上取决于其空间结构，蛋白质构象多样性导致了不同的生物学功能。蛋白质分子只有处于特定的三维空间结构情况下才能获得它特定的生物活性，三维空间结构稍有破坏，就很可能会导致蛋白质生物活性的降低甚至丧失。分析蛋白质结构、功能及其关系是蛋白质组学计划中的一个重要组成部分［１１-１３］。研究蛋白质结构有助于了解蛋白质的生物功能，这对认识蛋白质与蛋白质或与ＤＮＡ以及与ＲＮＡ之间的相互作用具有非常重要的生物学意义。对于未知功能或者新发现的蛋白质分子，利用ＥｘPASｙ等系统软件预测其功能和结构可提供理论性的参考，并对功能确认的生物学实验有重要指导作用［１４-１６］。通过分析蛋白质的结构，确认功能单位或者结构域，可以为遗传操作提供方向，为设计新的蛋白质或改造已有蛋白质提供可靠的依据。

通过跨膜螺旋结构和信号肽分析可以推测基因在细胞中的定位；而潜在功能位点的分析可以在对新基因及其编码蛋白信息一无所知的情况下初步推测基因的功能［１４］。研究结果显示，黔北麻羊ＲＥＲＧＬ基因蛋白没有跨膜螺旋结构域，且分子不包含信号肽序列，表明ＲＥＲＧＬ基因在细胞中起作用。

糖基化是在酶的控制下，蛋白质或脂质附加上糖类的过程。蛋白质经过糖基化作用之后可形成糖蛋白。蛋白质的糖基化，也叫美拉德反应，是在蛋白质基团特别是赖氨酸残基上加上多糖，可以改善蛋白质的很多性质，比如提高凝胶性、乳化性、水合性等，扩宽蛋白质的应用领域和范围［１７］。研究结果揭示黔北麻羊ＲＥＲＧＬ没有蛋白糖基化位点。

此次实验在黔北麻羊上成功克隆出ＲＥＲＧＬ基因序列并进行序列分析，为今后开展山羊ＲＥＲＧＬ基因表达、载体构建及转基因研究提供了基础资料。但其理化性质参数、跨膜肽段及结构是否是预测的理论结果需进一步实验证实。在没有任何信息可参考的前提下，本研究结果也可起到很好的参考作用，对正确认识蛋白质结构和功能具有启示作用。

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