三种簇角飞虱属昆虫１６ Ｓ ｒＤＮＡ序列及系统进化研究

侯晓晖 陈祥盛

摘要：通过ＰＣＲ扩增获得了飞虱科３属５种昆虫的１６ Ｓ ｒＤＮＡ序列，对ＤＮＡ序列进行测定，分析了其序列组成及变异。采用Ｍｅｇａ ４．０软件，利用邻接法（ＮＪ）和最大简约法（ＭＰ）进行５种飞虱的系统发育分析，结果显示构建的ＭＰ和ＮＪ分子系统树拓扑结构一致，３个簇角飞虱属物种中华簇角飞虱（Ｂｅｌｏｃｅｒａ． ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、褐额簇角飞虱（Ｂ． ｆｕｓｃｉｆｒｏｎｓ）和爬竹簇角飞虱（Ｂ． ａｍｐｅｌｏｃａｌａｍｕｓ）单独聚为一支，与偏角飞虱属海南偏角飞虱（Ｎｅｏｂｅｌｏｃｅｒａ ｈａｉｎａｎｅｎｓｉｓ）的亲缘关系较近，与短头飞虱属显脊短头飞虱（Ｅｐｅｕｒｙｓａ ｄｉｓｔｉｎｃｔａ）的亲缘关系较远，分子生物学分析结果与形态学研究结果一致。

关键词：飞虱科；簇角飞虱属（Ｂｅｌｏｃｅｒａ）；１６ Ｓ ｒＤＮＡ；系统发育

中图分类号：Ｑ９６９．３５文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）15－3355-03

Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ａｍｏｎｇ Ｔｈｒｅｅ Ｂｅｌｏｃｅｒａ Ｓｐｅｃｉｅｓ Ｉｎｆｅｒｒｅｄ ｆｒｏｍ １６ Ｓ ｒＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ

ＨＯＵ Ｘｉａｏ－ｈｕｉ１，２，ＣＨＥＮ Ｘｉａｎｇ－ｓｈｅｎｇ１

（１． Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙ， Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ／Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｐｅｓｔ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｏｕｎｔａｉｎｏｕｓ Ｒｅｇｉｏｎ， Ｇｕｉｙａｎｇ ５５００２５， Ｃｈｉｎａ； ２． Ｚｕｎｙｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｚｕｎｙｉ ５６３００３， Ｇｕｉｚｈｏｕ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ １６ Ｓ ｒＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ５ ｐｌａｎｔ ｈｏｐｐｅｒｓ ｂｅｌｏｎｇｉｎｇ ｔｏ ３ ｇｅｎｕｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｄｅｌｐｈａｃｉｄａｅ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ＰＣＲ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ． Ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｗere ａｎａｌｙｚｅｄ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅｓ ｗｅｒｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｂｙ ｍａｘｉｍｕｍ ｐａｒｓｉｍｏｎｙ ｍｅｔｈｏｄ（ＭＰ） ａｎｄ ｎｅｉｇｈｂｏｒ－ｊｏｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ（ＮＪ） ｕｓｉｎｇ Ｍｅｇａ ４．０ ｓｏｆｔｗａｒｅ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｔｏｐｏｌｏｇies ｏｆ ＭＰ ｔｒｅｅ ａｎｄ ＮＪ ｔｒｅｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｗere ｔｈｅ ｓａｍｅ． Ｂｅｌｏｃｅｒａ Ｓｉｎｅｎｓｉｓ， Ｂ． ｆｕｓｃｉｆｒｏｎｓ ａｎｄ Ｂ． ａｍｐｅｌｏｃａｌａｍｕｓ ｗｅｒｅ ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｉｎｔｏ ｏｎｅ ｇｒｏｕｐ， ｗｈｉｃｈ ｈａｄ ｃｌｏｓｅｒ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｔｏ Ｎｅｏｂｅｌｏｃｅｒａ ｈａｉｎａｎｅｎｓｉｓ ｗｈｉｌｅ ｆｕｒｔｈｅｒ ｄｉｓｔａｎｃｅ ｆｒｏｍ Ｅｐｅｕｒｙｓａ ｄｉｓｔｉｎｃｔa． Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｗｉｔｈ ｔｈose ｏｆ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｒｅｓｅａｒｃｈ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｄｅｌｐｈａｃｉｄａｅ； Ｂｅｌｏｃｅｒａ； １６ Ｓ ｒＤＮＡ； ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ

飞虱科（Ｄｅｌｐｈａｃｉｄａｅ）隶属于半翅目（Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ）蜡蝉总科（Ｆｕｌｇｏｒｏｉｄｅａ）［１］。该科昆虫许多种类是重要的农林害虫，它们通过刺吸汁液、产卵或传播植物病毒病等方式为害水稻、玉米、芦苇、甘蔗、竹子等，给农林生产造成巨大损失［２］。其中簇角飞虱属（Ｂｅｌｏｃｅｒａ）为外形比较独特的一个属，其触角矢状，严重危害竹类植物［２，３］。该属目前记录５种，均为东洋种，仅中国云南、贵州、海南、广东、台湾等地有分布记载［２，４，５］。与簇角飞虱属外形相似，同样具备矢状触角的偏角飞虱属（Ｎｅｏｂｅｌｏｃｅｒａ）也为害竹类植物，且与簇角飞虱属的分布极其相似［１，２，５］。为了更好地进行两近缘属的分类研究，选取飞虱科簇角飞虱属、偏角飞虱属及外类群短头飞虱属的５个物种，利用其１６ Ｓ ｒＤＮＡ序列片段进行系统发育分析，探讨两属间及种间的分子进化关系，以期为实际生产中害虫的鉴定提供一定的科学依据。

１材料与方法

１．１实验材料

簇角飞虱属中华簇角飞虱（Ｂ． ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、褐额簇角飞虱（Ｂ． ｆｕｓｃｉｆｒｏｎｓ）和爬竹簇角飞虱（Ｂ． ａｍｐｅｌｏｃａｌａｍｕｓ），偏角飞虱属海南偏角飞虱（Ｎ． ｈａｉｎａｎｅｎｓｉｓ）及短头飞虱属显脊短头飞虱（Ｅｐｅｕｒｙｓａ ｄｉｓｔｉｎｃｔａ），采集地信息见表１，采样后保存于无水乙醇中备用［６］。

１．２基因组ＤＮＡ的提取

将保存于无水乙醇中的供试虫体研磨碎，采用柱式动物基因组ＤＮＡ抽提试剂盒提取总ＤＮＡ，测定浓度后调整为１～２ ｎｇ／μＬ，保存于－２０ ℃冰箱备用。

１．３ＰＣＲ 扩增及产物检测

１６ Ｓ ｒＤＮＡ序列的引物设计参照文献［６］的方法，引物序列为１６Ｓ－ＰＦ ５′－ＧＣＣＴＧＴＴＴＡＴ ＣＡＡＡＡＡ

ＣＡＴ－３′；１６Ｓ－ＰＲ ５′－ＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡＣＴＣＡＧＡＴＣＡ－３′，由生工生物工程（上海）有限公司合成。ＰＣＲ反应体系为２５ μＬ，内含１０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ８．３），５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ，０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００，２．０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２，

０．２ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ，０．２ ｍｍｏｌ／Ｌ引物，１．０ Ｕ Ｔａｑ酶以及１ μＬ ＤＮＡ模板。ＰＣＲ反应程序为：９５ ℃预变性７ ｍｉｎ；９５ ℃变性５０ ｓ，５０ ℃退火１ ｍｉｎ，７２ ℃延伸１ ｍｉｎ，３５个循环；７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ。ＰＣＲ产物用１．０％的琼脂糖凝胶电泳检测其片段大小、纯度及含量。

１．４ＰＣＲ产物回收与测序

琼脂糖凝胶电泳检测后，对于扩增效果良好且足量的ＰＣＲ产物采用柱式胶回收试剂盒进行回收纯化，样品浓度达１００ ｎｇ／μＬ以上时，送宝生物工程（大连）有限公司测序。

１．５序列分析及分子系统树的重建

利用Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ ２．０对获得的序列进行比对，其参数设置为默认参数［７］，使用ＭＥＧＡ ４．０软件分析各物种间１６ Ｓ ｒＤＮＡ的碱基组成、遗传距离和转换／颠换值等［８］，在Ｋｉｍｕｒａ－２－ｐａｒａｍｅｔｅｒ模型的基础上，用邻接法（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－ｊｏｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ，ＮＪ）和最大简约法（Ｍａｘｉｍｕｍ ｐａｒｓｉｍｏｎｙ，ＭＰ）进行系统发育分析。在重建系统树时，以显脊短头飞虱的１６ Ｓ ｒＤＮＡ序列作为外类群，同时应用Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ［９］自举检验１ ０００次检验系统树中各结点的置信值。

２结果与分析

２．１５种飞虱１６ Ｓ ｒＤＮＡ序列碱基组成及序列变异

研究中获得的5种飞虱１６ Ｓ ｒＤＮＡ序列已登录ＧｅｎＢａｎｋ，登录号见表２。利用Ｍｅｇａ ４．０软件对所测１６ Ｓ ｒＤＮＡ序列进行统计，结果表明，这５种飞虱的１６ Ｓ ｒＤＮＡ序列平均长度为４７７ ｂｐ（包括Ｇａｐ），其中Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ含量分别为３７．３％、４０．８％、１４．１％、７．８％，Ａ＋Ｔ的平均含量为７８．１％，Ｇ＋Ｃ的平均含量为２１．９％；共检测到变异位点１２３个，其中简约信息位点５９个，自裔位点６４个，约占总序列的２５．８％。供试５种飞虱１６ Ｓ ｒＤＮＡ序列间颠换高于转换，转换数／颠换数平均值为０．４８。

２．２系统发育分析结果

从各物种１６ Ｓ ｒＤＮＡ序列的遗传距离（表２）来看，同属物种间的遗传距离较小，３种簇角飞虱间的遗传距离为０．１５３～０．２９１；属间遗传距离较大，为０．４０１～０．９６４，其中３个簇角飞虱属物种与海南偏角飞虱的遗传距离为０．４０１～０．５２６，与显脊短头飞虱的遗传距离均较远，为０．７５９～０．９６４。

根据序列分析结果，分别采用最大简约法（ＭＰ）和邻接法（ＮＪ）构建５种飞虱的分子系统树，得到一致的拓扑结构（图１、图２），Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ １ ０００次检验系统树各支均得到较高的支持率。从图１和图２中可以看出，簇角飞虱属３个种聚为一支，与海南偏角飞虱有较近的亲缘关系，短头飞虱属的显脊短头飞虱与其他４种飞虱的亲缘关系较远。

３讨论

３．１属间亲缘关系

如前所述，偏角飞虱属与簇角飞虱属形态较为相似，关系密切。由遗传距离分析结果来看，簇角飞虱属物种与偏角飞虱属间的遗传距离为０．４０１～０．５２６，远高于属内物种之间的遗传距离。另外，簇角飞虱属与偏角飞虱属虽亲缘关系较近且互为姐妹群，但仍各自构成一单系群，故两者作为独立的属级阶元是成立的；而簇角飞虱属与短头飞虱属亲缘关系相对较远，这与形态学研究结果非常吻合［２，５，９，１０］。

３．２属内亲缘关系

目前，中国已报道５种簇角飞虱［１０］，其形态特征较相似，本研究涉及了其中３种，其中爬竹簇角飞虱与褐额簇角飞虱间的遗传距离为０．１５３，而中华簇角飞虱与两者的遗传距离分别为０．２９１和０．２８３，表明其与这两个物种的亲缘关系相对较远，这一结果与形态分类的结果相吻合［１０］。

综上所述，本研究分析结果与丁锦华等［２］、Ｈｏｕ［１1］形态学分类的结果一致，这为用分子手段与形态学分类方法相结合，进行飞虱科昆虫种属的鉴定奠定了一定的基础。

参考文献：

［１］ 陈祥盛．同翅目：飞虱科［Ａ］．金道超，李子忠． 习水景观昆虫［Ｍ］． 贵阳： 贵州科技出版社， ２００５．１５１－１５８．

［２］ 丁锦华．中国动物志：第４５卷［Ｍ］．北京： 科学出版社，２００６．

［３］ 陈祥盛．中国飞虱科系统分类研究（同翅目：蜡蝉总科）［Ｄ］．重庆：西南农业大学，１９９９．

［４］ ＭＵＩＲ Ｆ． Ｏｎ ｓｏｍｅ ｎｅｗ Ｆｕｌｇｏｒｏｉｄｅａ［Ｊ］． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｈａｗａｉｉａｎ Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，１９１３，２（５）：２３７－２６９．

［５］ 丁锦华，杨莲芳，胡春林． 我国云南害竹飞虱的新属和新种记述（同翅目：飞虱科）［Ｊ］． 昆虫学报，１９８６，２９（４）：４１５－４２５．

［６］ ＹＥＨ Ｗ Ｂ， ＹＡＮＧ Ｃ Ｔ， ＨＵＩ Ｃ Ｆ． Ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ ｏｆ ｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒｓ （Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ： Ｆｕｌｇｏｒｏｉｄｅａ） ｉｎｆｅｒｒｅｄ ｆｒｏｍ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ １６ Ｓ ｒＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ［Ｊ］． Ｚｏｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ，２００５，４４（４）：５１９－５３５．

［７］ ＴＨＯＭＰＳＯＮ Ｊ Ｄ， ＨＩＧＧＩＮＳ Ｄ Ｇ， ＧＩＢＳＯＮ Ｔ Ｊ． Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ： Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ， ｐｏｓｉｔｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ ａｎｄ ｗｅｉｇｈｔ ｍａｔｒｉｘ ｃｈｏｉｃｅ［Ｊ］． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９９４，２２（２２）：４６７３－４６８０．

［８］ ＴＡＭＵＲＡ Ｋ， ＤＵＤＬＥＹ Ｊ， ＮＥＩ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ｍｅｇａ４： Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ （ＭＥＧＡ） ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０［Ｊ］． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，２００７，２４（８）：１５９６－１５９９．

［９］ ＦＥＬＳＥＮＳＴＥＩＮ Ｊ． Ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ｌｉｍｉｔｓ ｏｎ ｐｈｙｌｏｇｅｎｉｅｓ： Ａｎ ａｐｐｒｏａｃｈ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｂｏｏｔｓｔｒａｐ［Ｊ］． Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ， １９８５，３９（４）：７８３－７９１．

［10］ ＣＨＥＮ Ｘ Ｓ， ＹＡＮＧ Ｌ， ＴＳＡＩ Ｊ Ｈ． Ｒｅｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｍｂｏｏ ｄｅｌｐｈａｃｉｄ ｇｅｎｕｓ Ｂｅｌｏｃｅｒａ （Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ： Ｆｕｌｇｏｒｏｉｄｅａ： Ｄｅｌｐｈａｃｉｄａｅ）［Ｊ］． Ｆｌｏｒｉｄａ Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｉｓｔ，２００７，９０（４）：６７４－６８２．

［１1］ ＨＯＵ Ｘ Ｈ， ＣＨＥＮ Ｘ Ｓ． Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ Ｏｒｉｅｎｔａｌ ｂａｍｂｏｏ ｄｅｌｐｈａｃｉｄ ｇｅｎｕｓ Ｎｅｏｂｅｌｏｃｅｒａ Ｄｉｎｇ ＆ Ｙａｎｇ （Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ： Ｆｕｌｇｏｒｏｍｏｒｐｈａ： Ｄｅｌｐｈａｃｉｄａｅ） ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｏｎｅ ｎｅｗ ｓｐｅｃｉｅｓ［Ｊ］． Ｚｏｏｔａｘａ，２０１０，２３８７：３９－５０．