沙棘种子油中脂肪酸组成的微量分析

谢佳琦 李贺

摘要：以３个沙棘品种（亚历山大１２号、实优１号和丘伊斯克×中国无刺雄）的果实为材料，通过气－质联用法建立了沙棘种子油中脂肪酸组成的微量分析技术。脂肪酸用标准品结合质谱进行定性确证分析，脂肪酸组成用峰面积归一法计算。结果表明，沙棘种子油中富含不饱和脂肪酸（７１．２％～７６．０％），其中亚油酸（C１８∶２ｎ－６）含量最高（３５．６％～３９．０％），α－亚麻酸（C１８∶３ｎ－３）含量次之（２７．８％～３３．４％）。

关键词：沙棘（Ｈｉｐｐｏｐｈａｅ Ｌ．）；种子油；脂肪酸； 微量分析

中图分类号：Ｑ９４６．４文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）15－3319-04

Ｍｉｃｒｏａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｓｅｅｄ Ｏｉｌ ｉｎ Ｓｅａ Ｂｕｃｋｔｈｏｒｎ （Ｈｉｐｐｏｐｈａｅ Ｌ．）

ＸＩＥ Ｊｉａ－ｑｉ，ＬＩ Ｈｅ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ａｎｄ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ， Ｄａｌｉａｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｄａｌｉａｎ １１６６００， Ｎｉａｏｎｉｎｇ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａ ｍｉｃｒｏａｎａｌｙｓｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＧＣ－ＭＳ） ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ｉｎ ３ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｓｅｅｄ ｏｉｌ ｏｆ ｓｅａ ｂｕｃｋｔｈｏｒｎ， including Ｙａｌｉｓｈａnｄａ－１２， Ｓｈｉｙｏｕ－１ ａｎｄ Ｑｉｕｙｉｓｉｋｅ×Ｃｈｉｎｅｓｅ－Ｗｕｃｉｘｉｏｎｇ． Ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ｗｅｒｅ ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅｌｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｓｔａｎｄａｒｄｓ ｏｆ ｆａｔｔｙ ｏｉｌ ｂｙ ＭＳ． Ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｓｅｅｄ ｏｉｌ ｗｅｒｅ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｐｅａｋ ａｒｅａ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ａｃｉｄｓ（７１．２％～７６．０％） ｗｅｒｅ ｒｉｃｈ ｉｎ ｓｅｅｄ ｏｉｌ． Ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｓｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒａｎｇｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ３５．６％ ａｎｄ ３９．０％， α－ｌｉｎｏｌｅｎｉｃ ａｃｉｄ ｗａｓ ｓｅｃｏｎｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒａｎｇｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ２７．８％ ａｎｄ ３３．４％．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｓｅａ ｂｕｃｋｔｈｏｒｎ （Ｈｉｐｐｏｐｈａｅ Ｌ．）； ｓｅｅｄ ｏｉｌ； ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ； ｍｉｃｒｏａｎａｌｙｓｉｓ

沙棘（Ｈｉｐｐｏｐｈａｅ Ｌ．）又名醋柳，胡颓子科沙棘属的落叶灌木或小乔木，广泛分布于欧亚两洲的温带地区，有６个种，１２个亚种。中国是沙棘资源大国，种植面积已达２００万ｈｍ２，约占世界总面积的９０％以上，其中西北、华北、西藏、四川等林区都有丰富的沙棘天然资源［１，２］。沙棘具有极强的生态适应性，耐寒、耐旱、耐盐碱，固氮和繁殖能力强，广泛应用于土壤改良和水土保持。另外，沙棘的经济价值较高，其果实富含维生素Ｃ、Ｄ、Ｅ，类胡萝卜素、黄酮、不饱和脂肪酸等大量生物活性物质，可作为饮料、食品、化妆品和医药的原料［３－７］。

近几十年，国际上开发利用沙棘的研究工作由食品逐渐转入药品领域，如用于生产药用沙棘油等。沙棘油中富含不饱和脂肪酸，其中果油中的油酸含量最高，其次是棕榈油酸，而种子油中含有丰富的亚油酸和亚麻酸［８－１０］。沙棘种子油作为药用原料，广泛用于治疗烧伤、烫伤和冻伤等，对扁桃体炎、口腔炎和结膜炎等都有显著疗效，另外它还能调节免疫系统，对于心、脑血管系统疾病以及肿瘤、癌症等有预防作用［１１］。

我国从20世纪８０年代中期开始，从俄罗斯、芬兰等地引入多个沙棘优良品种，结合国内的种质资源进行良种选育，目前已选育出沙棘的新品种［１２－１４］。在沙棘种质资源评价的过程中，沙棘油成分是品质评价的重要指标，采用传统的方法，如索氏提取［１５］、超临界ＣＯ２萃取［１６，１７］等，需要采集大量样品，耗时费力，分析成本高。本试验建立了一种微量提取沙棘种子油并分析其脂肪酸组成的方法，该方法不仅可准确分析毫克级材料的脂肪酸组成，而且节省了分析成本，具有较好的应用价值。

１材料与方法

１．１材料与试剂

沙棘材料：亚历山大１２号（ｓｓｐ． ｍｏｎｇｏｌｉｃａ）、实优１号（ｓｓｐ． ｍｏｎｇｏｌｉｃａ）和丘伊斯克×中国无刺雄的果实均采自大连民族学院试验地，－５０ ℃保存。

３７种脂肪酸甲酯混合物标准品（４７８８５－Ｕ）和１．２５ ｍｏｌ／Ｌ盐酸－甲醇溶液购于Ｓｉｇｍａ公司。

正己烷、氯仿和甲醇均为色谱纯试剂，购于Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌ Ｂ＆Ｊ公司；氯化钾为国产分析纯试剂。

１．２仪器

ＧＣＭＳ－ＱＰ２０１０ Ｐｌｕｓ气质联用仪（岛津，日本），真空冷冻干燥机（Ｌａｂｃｏｎｃｏ，美国）。

１．３方法

１．３．１沙棘种子油的微量提取取５粒冷冻保存的果实（－５０ ℃）于１０ ｍＬ离心管，管口贴上封口膜（封口膜上用针扎适量小孔），打开Ｌａｂｃｏｎｃｏ真空冷冻干燥机，降温至－５０ ℃，放入该离心管，真空冻干４ d（０．１１ ｍＢａｒ，－５３ ℃）。冻干后，剥离果肉，取出种子（约０．３～０．５ ｇ），于研钵中轻捣，倒入液氮快速研磨至粉末状。称取约１００ ｍｇ左右样品粉末于２ ｍＬ离心管中，分别加入１ ｍＬ氯仿－甲醇溶液（体积比为２∶１）和２５０ μＬ酸洗玻璃珠（０．５ ｍｍ），高速振荡５ ｍｉｎ，然后放入液氮速冻５ ｍｉｎ，再于４℃下放置２ ｈ，裂解细胞，将细胞裂解液于４℃以１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，收集上清，加入３００ μＬ １％ ＫＣｌ，混匀，瞬时离心１ ｍｉｎ，收集氯仿层于另一离心管中，并用５００ μＬ氯仿重新提取原来的离心管，合并氯仿层，在快速真空器中挥发至干。

１．３．２样品甲酯化在上述的样品中加２００ μＬ正己烷和５００ μＬ盐酸－甲醇（１．２５ ｍｏｌ／Ｌ）溶液，混匀，依次在６０℃温浴２ ｈ，－２０℃中冷冻２０ ｍｉｎ后，加入２５０ μＬ １％ ＫＣｌ溶液（ｍ／V），混匀，分层后，收集正己烷层，挥发溶剂，于－２０℃保存。分析前向样品中加入５００ μＬ正己烷，０．４５ μｍ滤膜过滤后进行色谱分析。

１．３．３气相色谱条件Ｒｔｘ－５ＭＳ毛细管柱（３０ ｍ×０．２５ ｍｍ×０．２５ μｍ），柱温１２０ ℃，气化室温度２３０ ℃，载气（Ｈｅ）压力９８．１ kｐａ，气流速度１．２０ ｍＬ／ｍｉｎ，进样量１ μＬ，分流比２０∶１。柱箱升温程序：升温至１２０ ℃，保持２ ｍｉｎ，再以３ ℃／ ｍｉｎ升温至２３０ ℃，保持２０ ｍｉｎ。

１．３．４质谱条件离子源（ＥＩ）温度２００ ℃，接口温度２３０ ℃，检测器电压０．７４ ｋＶ，溶剂切除时间１．８ ｍｉｎ，质量扫描范围４０～６００ ａｍｕ。

２结果与分析

２．１微量提取的出油率

如表１所示，采用微量提取法获得的５粒沙棘果实的出油率均在２０％以上，其中实优１号的种子出油率达到３７．８％，与索氏提取法、超临界ＣＯ２萃取等方法相比，该法大大提高了种子的出油率。在冻干的果实中，丘伊斯克×中国无刺雄种子含量最高，但种子含油量相对较低；亚历山大１２号和实优１号种子含量相对较低，但种子出油率较高，说明这2个沙棘品种的种子含油量较高，是提取沙棘油的理想原料。从果实总体干重来看，种子油含量差距不大，约在５．０％左右。

２．２种子油脂肪酸组成分析

经优化的３７种标准脂肪酸甲酯总离子流图见图１。由图1可知，该色谱条件可分离标准脂肪酸甲酯。由图2可知，样本种子油中主要含有１２种脂肪酸，分别是十四烷酸（Ｃ１４∶０）、十五烷酸（Ｃ１５∶０）、棕榈酸（Ｃ１６∶０）、棕榈油酸（Ｃ１６：１）、十七烷酸（Ｃ１７∶０）、硬脂酸（Ｃ１８∶０）、油酸（Ｃ１８∶１ｎ－９）、亚油酸（Ｃ１８∶２ｎ－６）、α－亚麻酸（Ｃ１８∶３ｎ－３）、花生酸（Ｃ２０∶０）、反－１１－二十烯酸（Ｃ２０∶１）和二十二烷酸（Ｃ２２∶０）。图３-图５是３个品种沙棘种子油的脂肪酸总离子流色谱图，从样品色谱图看，该方法的甲酯化效果较好，样品中的脂肪酸均得到了较好的分离。

通过峰面积归一法计算并分析沙棘种子油中的主要脂肪酸相对含量（表２）。由表2可知，３个沙棘品种种子油的不饱和脂肪酸含量均高于７０％，其中以亚油酸（Ｃ１８：２ｎ-６）和α－亚麻酸（Ｃ１８：３ｎ-３）为主，其次是油酸（Ｃ１８：１ｎ-９）。亚历山大１２号、实优１号和丘依克斯×中国无刺雄的种子油中，亚油酸相对含量在３５．６%～３９．０％之间，平均为３７．１％，其中亚历山大１２号最高；α－亚麻酸的相对含量在２７．８%～３３．４％之间，平均为３０．３％，其中实优１号最高。由此可见，亚油酸和α－亚麻酸是沙棘种子油中最主要的不饱和脂肪酸，这也是开发利用沙棘种子油的重要依据。

３讨论

沙棘果肉和种子中的油脂含量很高，油脂含量是其主要的品质指标。由于基因型、海拔、气候和成熟期等因素的影响，不同品种沙棘果实和种子的含油量有很大差异。一般来说，沙棘种子油含量变化在６%～２０％（m／m）之间［１８－２０］，种子油中占优势的是Ｃ１８不饱和脂肪酸，包括油酸（Ｃ１８∶１）、亚油酸（Ｃ１８∶２）和亚麻酸（Ｃ１８∶３），其中亚油酸（Ｃ１８∶２ｎ－６）和α－亚麻酸（C１８∶３ｎ－３）特别丰富［２１，２２］。

对于沙棘种子油的提取方法而言，目前主要包括索氏提取法、超临界ＣＯ２萃取、氯仿－甲醇提取法等，这些方法常用于克级以上的油脂样品分析，样品量大。本试验成功运用微量提取技术分析了沙棘种子中总脂肪酸的含量及组成，该方法不需要大量样品，还可避免提取过程中的脂肪酸（尤其是不饱和脂肪酸）氧化分解产生的误差，另外，甲酯化方法具有操作简单、效率高、准确以及重现性好的优点，非常适合毫克级样品的油脂分析。该方法对于指导种子的资源考察、品种评价等具有一定的应用价值。

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