离子液体［ＢＭＩＭ］Ｃｌ对酿酒酵母生长及其乙醛脱氢酶活性的影响

刘洋洋 童彦杰 宋杨 等

摘要：设置单因素试验考察不同浓度离子液体氯化１－丁基－３－甲基咪唑（［ＢＭＩＭ］Ｃｌ）对酿酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＳ２．３９９生长及其乙醛脱氢酶活性的影响。结果表明，［ＢＭＩＭ］Ｃｌ对酵母的生长有抑制作用，且其浓度越高，抑制作用越明显；低浓度的［ＢＭＩＭ］Ｃｌ可以提高酵母乙醛脱氢酶的活性，高浓度则会抑制其活性。

关键词：氯化１－丁基－３－甲基咪唑（［ＢＭＩＭ］Ｃｌ）；酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＳ２．３９９；生长；乙醛脱氢酶活性

中图分类号：ＴＱ２０９；Ｑ１４２．３文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）15－3306-02

Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｉｏｎｉｃ Ｌｉｑｕｉｄ １－Ｂｕｔｙｌ－３－Ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ Ｃｈｌｏｒｉｎｅ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ａｌｄｅｈｙｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ

ＬＩＵ Ｙａｎｇ－ｙａｎｇ１，ＴＯＮＧ Ｙａｎ－ｊｉｅ２，ＳＯＮＧ Ｙａｎｇ２，ＺＨＡＮＧ Ｒｕｉ２，ＺＨＵ Ｓｈｅｎｇ－ｄｏｎｇ２，ＷＵ Ｙｕａｎ－ｘｉｎ１，２

（１．Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ ４３００７0， Ｃｈｉｎａ；

２． Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｙ， Ｗｕｈａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗｕｈａｎ ４３００７３， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｏｎｉｃ ｌｉｑｕｉｄ １－ｂｕｔｙｌ－３－ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｎｅ（［ＢＭＩＭ］Ｃｌ） ｏｎ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ａｌｄｅｈｙｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＡＬＤＨ） ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＳ２．３９９ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ ｓｉｇｎａｌ ｆａｃｔｏｒ ｔｅｓｔｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ［ＢＭＩＭ］Ｃｌ ｃｏｕｌｄ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｙｅａｓｔ． Ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈｅ［ＢＭＩＭ］Ｃｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ， ｔｈｅ ｍｏｒｅ ｏｂｖｉｏｕｓ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ｗａｓ． Ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＡＬＤＨ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｐｒｏｍｏｔｅｄ ｂｙ ｌｏｗ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ［ＢＭＩＭ］Ｃｌ ｗｈｉｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｂｙ ｈｉｇｈ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： １－ｂｕｔｙｌ－３－ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｎｅ（［ＢＭＩＭ］Ｃｌ）； Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＳ２．３９９； ｇｒｏｗｔｈ； ＡＬＤＨ ａｃｔｉｖｉｔｙ

离子液体（Ｉｏｎｉｃ ｌｉｑｕｉｄｓ，ＩＬｓ）是指在室温或者接近于室温下呈液态的由离子构成的有机盐［１］。离子液体作为一种新型有机溶剂，具有无可测蒸汽压、可循环使用、对空气无污染等优点［２，３］，已被成功地应用到化学合成、化学分离以及电化学等方面［４］。随着离子液体在工业上的广泛应用，其自身的绿色性也越来越受到关注，如其在自然界和生物体内如何降解，累积度对生物体的毒性如何等［５］。乙醛脱氢酶又称醛脱氢酶，是一类依赖ＮＡＤ（Ｐ）的氧化还原酶，可催化乙醛或其他醛类转化成对应的酸类［６，７］，能缓解饮酒后大量乙醇代谢成乙醛对人体造成的毒害［８］，是近年来研究的热点［９，１０］。本研究以实际生产中应用最为广泛的离子液体氯化１－丁基－３－甲基咪唑盐（［ＢＭＩＭ］Ｃｌ）为研究对象，考察其对酿酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＳ２．３９９生长及其乙醛脱氢酶活性的影响，为离子液体的推广应用及安全性鉴定提供一定的理论依据。

１材料与方法

１．１材料与仪器

酿酒酵母ＡＳ２．３９９为武汉工程大学化工与制药学院４１２实验室保藏菌株。实验用离子液体［ＢＭＩＭ］Ｃｌ购自河南利华制药公司；其他化学试剂均购自国药集团化学试剂有限公司；生物培养基购自北京双旋微生物培养基制品厂。Ｏｎｅ ｓｈｏｔ高压细胞破碎仪（Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ）；ＵＶ－２１０２ＰＣ型紫外分光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司）；ＵＮＩＶＥＲＳＡＬ ３２Ｒ台式冷冻离心机（德国Ｈｅｔｔｉｃｈ公司）。

１．２方法

１．２．１［ＢＭＩＭ］Ｃｌ对酵母菌体生长的影响分别配制［ＢＭＩＭ］Ｃｌ浓度为０．００１、０．１００、２．０００、５．０００、２５．０００、５０．０００和１００．０００ ｍｇ／ｍＬ的ＹＰＤ液态培养基，接种后培养基ＯＤ６００ ｎｍ＝０．１２５，培养至菌体生长到一定浓度时取样（接种后每隔２～３ ｈ取样，具体根据菌体生长情况决定，下同）并测定其在６００ ｎｍ处的吸光度。

１．２．２［ＢＭＩＭ］Ｃｌ对酵母乙醛脱氢酶活性的影响将酵母接种到添加了不同浓度［ＢＭＩＭ］Ｃｌ的ＹＰＤ培养基中，每隔２～３ ｈ取样测ＯＤ６００ ｎｍ，并稀释到ＯＤ６００ ｎｍ＝１．０００，用高压细胞破碎仪将其破碎，４ ℃下12 ０００ ｒ／ｍｉｎ离心５ ｍｉｎ，取３００ μＬ上清液加入酶活反应体系（２０ ｍｍｏｌ／Ｌ烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 ０．１0 ｍＬ、１ ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ０．３0 ｍＬ（ｐＨ ８．０）、１ ｍｏｌ／Ｌ巯基乙醇 ０．０５ ｍＬ、１００ ｍｍｏｌ／Ｌ乙醛０．１0 ｍＬ、３ ｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ ０．１0 ｍＬ；双蒸水２．０５ ｍＬ），立即测试其在３４０ ｎｍ处的吸光度。

１．２．３对数生长期添加［ＢＭＩＭ］Ｃｌ对酵母生长的影响将酵母菌体接种到ＹＰＤ培养基中，初始ＯＤ６００ ｎｍ＝０．１２５，３０ ℃、２００ ｒ／ｍｉｎ振荡培养１８ ｈ后分装到不同的无菌培养瓶中，添加５０ μＬ含不同浓度［ＢＭＩＭ］Ｃｌ的YPD培养基。每隔２～３ ｈ取样并测其ＯＤ６００ ｎｍ。

２结果与分析

２．１不同浓度［ＢＭＩＭ］Ｃｌ对酵母菌体生长的影响

如图１所示，酵母ＡＳ２．３９９的生长曲线随着［ＢＭＩＭ］Ｃｌ浓度的不同而变化，［ＢＭＩＭ］Ｃｌ会使菌体提前进入稳定期，从而降低培养基中的菌体浓度。［ＢＭＩＭ］Ｃｌ浓度越高，其对菌体生长的影响越大，菌体越早进入稳定期。当［ＢＭＩＭ］Ｃｌ浓度达到１００.000 ｍｇ／ｍＬ时，菌体的生长被严重抑制，在培养基中浓度的增幅很小。［ＢＭＩＭ］Ｃｌ浓度为０．００１、０．１００、２．０００、５．０００、２５．０００、５０．０００和１００．０００ ｍｇ／ｍＬ时，培养40 h 后培养基中菌体的浓度分别为对照组的９２％、７５％、６４％、５７％、３８％、３１％、８％。

２．２［ＢＭＩＭ］Ｃｌ对酵母乙醛脱氢酶活性的影响

为保证酵母菌体的浓度相同，以反映单个细胞内乙醛脱氢酶活性的差异，将测试酶活的样品稀释到相同的浓度（ＯＤ６００ ｎｍ＝１．０００）。如图２所示，不同浓度的［ＢＭＩＭ］Ｃｌ对菌体乙醛脱氢酶活性的影响不同。低浓度（０．００１、０．１００ ｍｇ／ｍＬ）的［ＢＭＩＭ］Ｃｌ下菌体的乙醛脱氢酶活性比对照有所升高，但当［ＢＭＩＭ］Ｃｌ浓度大于２．０００ ｍｇ／ｍＬ时，菌体的乙醛脱氢酶活性受到抑制，并且随着其浓度的升高，抑制作用越明显。

２．３对数生长期添加［ＢＭＩＭ］Ｃｌ对酵母菌体生长的影响

当酵母菌体生长到对数期时，添加不同浓度的［ＢＭＩＭ］Ｃｌ以考察其对菌体生长的影响。由图３可知，［ＢＭＩＭ］Ｃｌ对菌体的生长有明显的影响，其不同的浓度对菌体有不同程度的生物毒性。［ＢＭＩＭ］Ｃｌ浓度小于１．０００ ｍｇ／ｍＬ时，其对菌体的生长有抑制作用，但此时菌体尚未出现生长停滞状态；而［ＢＭＩＭ］Ｃｌ浓度为５０．０００ ｍｇ／ｍＬ时，其严重抑制了菌体的生长，菌体的生长基本处于停滞状态。

３结论

培养基中添加不同浓度的［ＢＭＩＭ］Ｃｌ对酿酒酵母ＡＳ２．３９９的生长有抑制作用，观察发现高浓度的［ＢＭＩＭ］Ｃｌ处理比对照组中存在更多的死酵母。因此，在［ＢＭＩＭ］Ｃｌ大规模使用的工业化生产中，必须先对废液进行处理后才能排放，否则会对周边环境中的微生物造成毒害作用，从而破坏生态平衡。低浓度的［ＢＭＩＭ］Ｃｌ对酵母乙醛脱氢酶的活性有促进作用，可能是因为菌体在［ＢＭＩＭ］Ｃｌ胁迫下的一种自我保护措施。然而高浓度的［ＢＭＩＭ］Ｃｌ具有生物毒性，会对菌体产生不可逆转的破坏作用。

参考文献：

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［２］ 童彦杰，王启军，马亚丽，等． 离子液体［ＢＭＩＭ］Ｃｌ对土壤理化性质及其微生物的影响［Ｊ］．武汉工程大学学报，２０１１，３３（８）：２５－２９．

［３］ ＺＨＵ Ｓ， ＷＵ Ｙ， ＣＨＥＮ Ｑ， ｅｔ ａｌ． Ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｗｉｔｈ ｉｏｎｉｃ ｌｉｑｕｉｄｓ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ：Ａ ｍｉｎｉ－ｒｅｖｉｅｗ［Ｊ］．Ｇｒｅｅｎ Ｃｈｅｍ， ２００６，８（４）：３２５－３２７．

［４］ 郑燕升，莫倩． 离子液体工业化应用及关键技术问题［Ｊ］．化工新型材料，２０１０（３）：１６－１８．

［５］ 骆爱兰，何建玲．离子液体胁迫下土壤蔗糖酶活性［Ｊ］． 中国农学通报，２０１１，２７（３０）：８８－９２．

［６］ ＭＯＯＮ Ｋ Ｈ， ＡＢＤＥＬＭＥＧＥＥＤ Ｍ Ａ， ＳＯＮＧ Ｂ Ｊ． Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｖｉａ Ｓ－ｎｉｔｒｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｅｔｈａｎｏｌ－ｅｘｐｏｓｅｄ ｒａｔ ｌｉｖｅｒ［Ｊ］． ＦＥＢＳ Lｅｔｔｅｒｓ，２００７，５８１（２１）：３９６７－３９７２．

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［８］ 赵锦，赵玉凤，黄锟，等．人乙醛脱氢酶２基因在毕赤酵母中的高效表达［Ｊ］．化学与生物工程，２０１０（２）：５０－５２．

［９］ 黄瑞，王璐，沈微，等． 酿酒酵母乙醛脱氢酶的克隆与表达［Ｊ］．工业微生物，２００９，３９（１）：２２－２７．

［１０］ 张鸿达，刘成，高卫华，等．微生物发酵法生产３－羟基丙酸的研究进展［Ｊ］．化工进展，２００７，２６（１）：３３－３６．