马齿苋多糖对雏鸡胸腺免疫功能的影响及其机制

2012-04-29葛剑杨翠军孙茂红等

湖北农业科学 2012年15期

关键词：雏鸡

葛剑杨翠军孙茂红等

摘要：为了观察马齿苋多糖（Ｐｏｒｔｕｌａｃｅ oｌｅｒａｃｅａｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ＰＯＰ）对雏鸡胸腺免疫功能的影响，并探讨其可能的作用机制，试验通过对雏鸡灌注不同剂量的ＰＯＰ，测定雏鸡胸腺指数，应用ＭＭＴ（四甲基偶氮唑盐比色法）方法测定雏鸡胸腺淋巴细胞转化率，利用流式细胞器测定雏鸡胸腺淋巴细胞周期与胸腺Ｔ淋巴细胞亚群的变化。结果表明，ＰＯＰ能显著增加雏鸡胸腺淋巴细胞转化率和胸腺指数（Ｐ＜０．０５），淋巴细胞增殖指数显著提高（Ｐ＜０．０５），ＣＤ４＋Ｔ淋巴细胞含量显著增加（Ｐ＜０．０５），ＣＤ８＋Ｔ淋巴细胞数量变化不明显，ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ淋巴细胞比值显著升高（Ｐ＜０．０５）。ＰＯＰ可通过调节雏鸡胸腺内细胞水平的变化，增强雏鸡细胞免疫功能，促进免疫系统发育。

关键词：雏鸡；马齿苋多糖（ＰＯＰ）；胸腺指数；淋巴细胞转化率；淋巴细胞增殖指数；ＣＤ４＋／ＣＤ８＋

中图分类号：Ｒ２８５；Ｓ８５２．４文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）15－3264-03

ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＰｏｒｔｕｌａｃｅ oｌｅｒａｃｅａ PｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｏｎＴｈｙｍｕｓＩｍｍｕｎｅＦｕｎｃｔｉｏｎｉｎＣｈｉｃｋｅｎａｎｄＩｔｓＭｅｃｈａｎｉｓｍ

ＧＥＪｉａｎa，ＹＡＮＧＣｕｉ－ｊｕｎb，ＳＵＮＭａｏ－ｈｏｎｇa，ＬＩＸｉｕ－ｈｕａa

（a．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；b．ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ，ＨｅｂｅｉＮｏｒｔｈＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈａｎｇｊｉａｋｏｕ０７５０００，Ｈｅｂｅｉ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｏｏｂｓｅｒｖｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＰＯＰ（Ｐｏｒｔｕｌａｃｅ oｌｅｒａｃｅａｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）ｏｎｔｈｅｃｈａｎｇｅｏｆｔｈｙｍｕｓｉｍｍｕｎｅｆｕｎｔｉｏｎｉｎｃｈｉｃｋｅｎ，ａｎｄｓｔｕｄｙｉｔｓｍｅｃｈａｎｉｓｍ，４０ｃｈｉｃｋｅｎｓｗｅｒｅｒａｎｄｏｍｌｙａｌｌｏｃａｔｅｄｔｏ４ｇｒｏｕｐｓａｎｄｆｅｄｗｉｔｈＰＯＰｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｅｖｅｌ. Aｎｄｔｈｅｎｔｈｅｔｈｙｍｕｓｉｎｄｅｘｅｓ，ｔｈｅｔｈｙｍｕｓｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｒａｔｅｏｆＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅａｎｄｔｈｅｃｈａｎｇｅｏｆＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅａｎｄｔｈｙｍｕｓｃｅｌｌｐｅｒｉｏｄｗｅｒｅｍｅａｓｕｒｅｄｂｙ３－（４，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）－２，５－ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃｍｅｔｈｏｄ（ＭＴＴ）ａｎｄｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｔｈｙｍｕｓｉｎｄｅｘｅｓ，ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｒａｔｅｏｆｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ，ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｉｎｄｉｃｅｓ（ＬＰＩ），ａｎｄｔｈｅＣＤ４＋ＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｏｆＰＯＰｇｒｏｕｐｓｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）. Tｈｅｒｅ was ｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｃｈａｎｇｅｉｎＣＤ８＋Ｔｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ；ａｎｄｔｈｅｒａｔｉｏｂｅｔｗｅｅｎＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ was ｉｎｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜０．０５）．Ｉｔ was ｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔＰＯＰｃｏｕｌｄｅｎｈａｎｃｅｔｈｅｉｍｍｕｎｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｉｍｍｕｎｉｔｙｉｎｃｈｉｃｋｅｎｂｙａｄｊｕｓｔｉｎｇｔｈｅｃｅｌｌｌｅｖｅｌ changes ｉｎｔｈｙｍｕｓ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｃｈｉｃｋｅｎ；ＰＯＰ；ｔｈｙｍｕｓｉｎｄｅｘｅｓ；ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｒａｔｅｏｆｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ；ＬＰＩ；ＣＤ4＋／ＣＤ８＋

中药多糖广泛存在于植物、动物和微生物细胞和细胞壁中，具有促进机体免疫力、抗菌、抗病毒、抗寄生虫、抗肿瘤、抗辐射、抗炎、降低血脂以及改善动物生产性能等一系列作用。其中多糖的免疫调节作用是主要的，它对机体的特异性和非特异性免疫功能具有增强作用，其作用机制是通过刺激单核-巨噬细胞系统的吞噬功能、促进淋巴细胞增殖和转化、促进抗体生成、诱导细胞因子的分泌、激活补体系统等途径实现对机体免疫系统功能的调节。尤其是中药多糖作为一种几乎无毒副作用的天然提取物，其药理作用甚广，在促生长及增强机体免疫方面有着重要的作用，是一类天然免疫增强剂［１－３］。

中药马齿苋（ＰｏｒｔｕｌａｃａｏｌｅｒａｃｅａＬ．）为药食两用马齿苋科植物，是我国卫生部划定的７８种药食同源的野生植物之一。含有多种化学成分，包括蛋白质、脂肪、维生素、氨基酸、多糖、生物碱、黄酮类等，具有抗氧化、抗菌、增强免疫功能等药理活性作用。其中马齿苋多糖（Ｐｏｒｔｕｌａｃａｏｌｅｒａｃｅａｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ＰＯＰ）是马齿苋的主要有效成分之一，已引起人们越来越多的关注。现代药理学研究表明，马齿苋多糖具有提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能、促进淋巴细胞转化、提高正常家兔淋巴细胞和ＰＨＡ诱导的淋巴细胞的增殖能力、扶植肠道正常菌群生长、调整菌群失调、防止感染等功能；并具有促进大鼠受损结肠黏膜修复，缓解大鼠溃疡性结肠炎的效应［４－８］。但迄今为止，关于马齿苋多糖对机体免疫机能的影响研究报道较少。本试验通过对雏鸡灌注不同剂量的ＰＯＰ，观察雏鸡胸腺指数、外周血淋巴细胞转化率、胸腺内细胞周期的变化，探讨ＰＯＰ对雏鸡免疫性能的影响，以期为马齿苋在兽医临床中的应用提供参考。

１材料与方法

１．１试验材料

马齿苋多糖：马齿苋原药购自张家口市中医院，马齿苋多糖系自行制备（在实验中心制备）；试验动物：１日龄雏鸡由河北北方学院牧业研究所提供；主要仪器：ＦＡＣＳＡｒｉａ流式细胞仪（美国）；试剂：淋巴细胞分离液，ＰＥ（苯肾上腺素）荧光标记小鼠抗鸡ＣＤ４、ＣＤ８抗体，碘化丙啶，ＣｏｎＡ。

１．２试验方法

试验选用１日龄雏鸡４０只（体重差异不显著）随机分为４组：空白对照组Ⅰ和３个POP不同剂量试验组，分别为Ⅱ（POP剂量为２５ｍｇ／ｋｇ）、Ⅲ（POP剂量为５０ｍｇ／ｋｇ）、Ⅳ（POP剂量为１００ｍｇ／ｋｇ），每组１０只，ＰＯＰ采用注射器口腔灌注，每天１次，试验期３周，至２１日龄结束；对照组灌注相同体积的生理盐水；基础日粮均统一饲喂商品育雏鸡料，自由采食和饮水。

试验结束，各组分别称重后颈部放血处死。无菌摘取雏鸡胸腺，称重并计算胸腺指数，胸腺指数＝胸腺湿重（ｍｇ）／体重（ｇ）。利用ＭＴＴ法（四甲基偶氮唑盐比色法）测定由ＣｏｎＡ（刀豆素Ａ）诱导的胸腺淋巴细胞转化率，胸腺淋巴细胞转化率以刺激指数（Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｉｎｄｅｘ，ＳＩ）表示，ＳＩ＝ＣｏｎＡ刺激孔OＤ５７０ｎｍ／对照孔OＤ５７０ｎｍ。采用流式细胞仪检测胸腺淋巴细胞周期和Ｔ淋巴细胞亚群变化，ＭｏｄＦｉｔ软件分析细胞周期和淋巴细胞增殖指数（ＰＩ），ＰＩ＝（Ｓ＋Ｇ２／Ｍ）／（Ｇ１／Ｇ０＋Ｓ＋Ｇ２／Ｍ）×１００％（Ｇ１期：ＤＮＡ合成前期；Ｓ期：ＤＮＡ合成期；Ｇ２期：ＤＮＡ合成后期；Ｍ期：细胞分裂期；Ｇ０期：暂时离开细胞周期，停止细胞分裂）。

１．３数据统计

流式细胞仪所测数据利用ＣＥＬＬＱＵＥＳＴ软件进行分析；利用ＳＰＳＳ软件进行统计学分析和显著性检验，用ＬＳＤ法进行多重比较，结果以“平均值±标准差”表示。

２结果与分析

２．１POP对雏鸡胸腺指数和胸腺淋巴细胞转化率的影响

由表１可见，不同剂量ＰＯＰ饲喂雏鸡后，相对于对照组而言，ＰＯＰ各剂量组由ＣｏｎＡ诱导的胸腺淋巴细胞转化率均显著提高（Ｐ＜０．０５），其中以ＩＶ组胸腺淋巴细胞的增殖转化能力最强；随着POP剂量增加，ＰＯＰ各剂量组雏鸡的胸腺指数显著增高，且组间差异均显著（Ｐ＜０．０５）。由此表明ＰＯＰ可显著促进雏鸡胸腺淋巴细胞的增殖。

２．２POP对雏鸡胸腺淋巴细胞增殖指数变化的影响

雏鸡经不同剂量ＰＯＰ处理后，胸腺细胞周期发生变化。由表２可见，从对照组（Ⅰ）到试验组（Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ），随着ＰＯＰ剂量的增加，处于Ｇ１／Ｇ０期细胞所占比例显著降低（Ｐ＜０．０５），Ｓ期和Ｇ２／Ｍ期细胞所占比例显著升高（Ｐ＜０．０５），其中Ｇ２／Ｍ期细胞在２５ｍｇ／ｋｇ和５０ｍｇ／ｋｇ剂量组间差异不显著（Ｐ＞０．０５），胸腺的ＰＩ值显著上升（Ｐ＜０．０５）。胸腺内细胞以Ｇ１／Ｇ０期为主，在８６％～９５％之间。

２．３POP对雏鸡胸腺Ｔ淋巴细胞ＣＤ４＋、ＣＤ８＋亚群的影响

由表３可见，试验Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组与对照组相比，胸腺ＣＤ４＋Ｔ淋巴细胞数量均显著升高（Ｐ＜０．０５），随着ＰＯＰ剂量的增加，试验Ⅲ组和Ⅳ组ＣＤ４＋Ｔ淋巴细胞数量均显著高于Ⅱ组（Ｐ＜０．０５），但Ⅲ组和Ⅳ组间差异不显著。雏鸡经不同剂量的ＰＯＰ处理后，胸腺ＣＤ８＋Ｔ淋巴细胞数量均出现一定程度的增加，但各试验组与对照组相比差异均不显著（Ｐ＞０．０５）。表明ＰＯＰ在对雏鸡灌服３周内，能显著增加其胸腺ＣＤ４＋Ｔ淋巴细胞数量，提高其ＣＤ４＋／ＣＤ８＋比值。

３小结与讨论

中药多糖毒性小，广泛参与机体免疫代谢，人们对中药多糖的研究日益增多。齐春会等［９］研究发现，六味地黄多糖口服给药对环磷酞胺处理小鼠脾细胞抗体生成反应能力低下具有明显的改善作用，体外应用可直接促进小鼠脾细胞增殖反应；Ｈａｎ等［１］研究发现，Ａｅａｎｔｈｏｐａｎａｘｋｏｒｅａｎｕｍ（ＡＫ）多糖直接增强Ｂ细胞增殖和抗体产生，能够显著增加ＩｇＭ的产生，促进Ｂ细胞增殖；Ｂｅｎｄａ等［１０］在猪上试验了啤酒酵母多糖的佐剂活性，发现其可以显著促进小牛血清白蛋白和绵羊血清中人白蛋白抗体水平。

马齿苋别名五行草、马齿菜、长命菜等，为马齿苋科一年生肉质草本野生植物，分布于全世界温带和热带地区。我国马齿苋资源丰富，分布广泛，其不仅具有药用价值，还有很高的营养价值。现代药理学研究发现，马齿苋包含多糖类、黄酮类、生物碱类等多种化学成分，其中马齿苋多糖具有抗氧化活性，并有提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能，促进淋巴细胞转化，调节机体免疫等功能［１１，１２］。本试验应用不同剂量的ＰＯＰ对雏鸡进行口腔灌注，结果发现ＰＯＰ能够剂量依赖性提高雏鸡胸腺指数及胸腺淋巴细胞转化率。而胸腺是禽类重要的中枢免疫器官之一，为Ｔ淋巴细胞分化成熟的场所，胸腺的发育程度与雏鸡免疫功能的发挥密切相关。证实ＰＯＰ能够有效促进免疫器官的发育，且与ＰＯＰ具有剂量效应关系，随灌注剂量增大其效应相应增强。

应用流式细胞术ＰＩ染色法对细胞内ＤＮＡ含量进行检测时，可以将细胞周期各时相区分为Ｇ１／Ｇ０期，Ｓ期和Ｇ２／Ｍ期，并可通过特殊软件计算各时相的百分率。Ｇ１期为细胞进行大量物质合成时期。Ｇ０期指细胞处于阻留的状态，Ｇ０期是脱离细胞周期暂时停止分裂的一个阶段，但在一定适宜刺激下又可进入周期，合成ＤＮＡ与分裂。Ｓ期指在这一阶段完成ＤＮＡ的合成以及合成与ＤＮＡ组装构成染色质等有关的组蛋白，ＤＮＡ含量在此时期增加1倍。Ｇ２期是ＤＮＡ复制结束和开始有丝分裂之间的间隙，在这期间细胞合成某些蛋白质和ＲＮＡ分子，为进入有丝分裂提供物质条件。Ｍ期为有丝分裂时期，是细胞形态结构发生快速变化的时期［１３］。本试验结果显示，不同剂量的ＰＯＰ灌注雏鸡后，胸腺细胞周期发生显著改变，并且随ＰＯＰ剂量的增大，雏鸡脾脏内Ｇ１／Ｇ０期细胞的数量显著降低，Ｓ期和Ｇ２／Ｍ期细胞数量增加，导致胸腺细胞周期指数（ＰＩ）显著增加，有效提高了雏鸡免疫器官内细胞的增殖。

ＣＤ４和ＣＤ８分子是Ｔ细胞表面Ⅰ型跨膜糖蛋白，也是其表面标志。ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ淋巴细胞数量与鸡的免疫防御关系密切［１４，１５］。本试验结果显示，雏鸡灌注不同剂量的ＰＯＰ后，ＣＤ４＋Ｔ淋巴细胞数量各试验组均较对照组显著提高，对ＣＤ８＋Ｔ淋巴细胞数量影响不明显，但显著提高了ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ淋巴细胞比值。说明ＰＯＰ可通过增加ＣＤ４＋Ｔ细胞亚群数量，促进胸腺的生长发育，增强雏鸡的免疫力。

４结论

马齿苋多糖能够提高雏鸡胸腺淋巴细胞转化率和胸腺指数，显著提高淋巴细胞增殖指数及ＣＤ４＋Ｔ淋巴细胞亚群含量，增强雏鸡细胞免疫功能，促进其免疫器官的发育。

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