树莓果实维生素Ｃ积累与其合成氧化酶的关系

张丙秀 高媛 陈倩 高庆玉

摘要：对４个品种的树莓（Ｒｕｂｕｓ ｉｄａｅｕｓ）果实生长过程中还原型维生素Ｃ（ＡｓＡ）、氧化型维生素Ｃ（ＤＨＡ）及总维生素Ｃ含量进行了分析，并对Ｌ－半乳糖酸－１，４－内酯脱氢酶（ＧａｌＬＤＨ）、抗坏血酸氧化酶（ＡＡＯ）及抗坏血酸过氧化物酶（ＡＰＸ）３种酶的活性进行了测定分析。结果显示，ＡｓＡ和总维生素Ｃ含量随着果实的成熟而逐渐上升。４个品种中ＧａｌＬＤＨ活性与ＡsＡ积累之间均呈显著正相关。ＡＡＯ和ＡＰＸ活性与ＡｓＡ含量相关性不显著，而ＡＰＸ活性与ＤＨＡ含量呈显著正相关。说明不同树莓品种间维生素Ｃ含量存在差异的原因与其ＧａｌＬＤＨ及ＡＰＸ活性有关。

关键词：树莓；维生素Ｃ；ＧａｌＬＤＨ；ＡＡＯ；ＡＰＸ

中图分类号：Ｓ６６３；Ｑ５６４；Ｑ５５９文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）15－3243-03

Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｖｉｔａｍｉｎ Ｃ Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈａｓｅ ｏｒ Ｏｘｉｄａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ Rubis idaeus Fruit

ＺＨＡＮＧ Ｂｉｎｇ－ｘｉｕ，ＧＡＯ Ｙｕａｎ，ＣＨＥＮ Ｑｉａｎ，ＧＡＯ Ｑｉｎｇ－ｙｕ

（Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｈａｒｂｉｎ １５００３０，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： The aｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ （ＡｓＡ）， Ｄｅｈｙｄｒｏａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ （ＤＨＡ） ａｎｄ ｔｏｔａｌ ｖｉｔａｍｉｎ Ｃ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｆｏｕｒ ｒａｓｐｂｅｒｒｙ （Ｒｕｂｕｓ ｉｄａｅｕｓ） ｖａｒｉｅｔｉｅｓ ｗｅｒｅ ｔｅｓｔｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ｆｒｕｉｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ； ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｌ－ｇａｌａｃｔｏｎｏ－１，４－ｌａｃｔｏｎｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ （ＧａｌＬＤＨ）， ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ（ＡＡＯ） ａｎｄ ａｓｃｏｒｂａｔｅ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＡＰＸ） ｗｅｒｅ ａｌｓｏ ｍｅａｓｕｒｅｄ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ＡｓＡ ａｎｄ ｖｉｔａｍｉｎ Ｃ ｃｏｎｔｉｎｕａｌｌｙ ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｆｒｕｉｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． ＧａｌＬＤＨ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｈｉｇｈｌｙ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ＡＳＡ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ． ＡＡＯ ａｎｄ ＡＰＸ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｈａｄ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ＡｓＡ； ｂｕｔ ＡＰＸ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ＤＨＡ ｃｏｎｔｅｎｔ， which ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ｖｉｔａｍｉｎ Ｃ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｒａｓｐｂｅｒｒｙ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ was ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ＧａｌＬＤＨ ａｎｄ ＡＰＸ ａｃｔｉｖｉｔｙ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｒａｓｐｂｅｒｒｙ（Ｒｕｂｕｓ ｉｄａｅｕｓ）； ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ； ＧａｌＬＤＨ； ＡＡＯ； ＡＰＸ

维生素Ｃ是一种普遍存在于植物和大多数动物体内的一类高丰度己糖内酯化合物，而人类等少数动物自身不能合成维生素Ｃ，必须通过食物获得［１］。所以，维生素Ｃ含量已成为果品质量的重要指标。维生素Ｃ对植物自身也具有重要意义，维生素Ｃ作为植物体内重要的还原剂之一，不仅参与清除植物光合、呼吸作用过程中产生的活性氧，而且作为多个酶的辅酶在多种生理代谢中发挥作用［２］。维生素Ｃ的还原态称为抗坏血酸（Ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ，ＡｓＡ）， 氧化态统称为脱氢抗坏血酸（Ｄｅｈｙｄｒｏａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ，ＤＨＡ），二者都具有生物活性，并可相互转化［２］。Ｌ－半乳糖酸－１，４－内酯脱氢酶（ＧａｌＬＤＨ）是ＡｓＡ生物合成途径的关键酶［３］。抗坏血酸氧化酶（ＡＡＯ）和抗坏血酸过氧化物酶（ＡＰＸ）催化ＡｓＡ形成不稳定的单脱氢抗坏血酸（ＭＤＨＡ），再经过非酶歧化反应形成脱氢抗坏血酸（ＤＨＡ），ＤＨＡ除了部分被还原为ＡｓＡ外，其余的被氧化为２，３－二酮古洛糖酸［２］。

树莓为蔷薇科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）悬钩子属（Ｒｕｂｕｓ）多年生小灌木，其果实风味独特，含有丰富的维生素Ｃ。目前关于树莓果实中维生素Ｃ积累的生理机制尚不清楚。本试验研究了４个不同品种树莓果实发育过程中维生素Ｃ含量变化与ＧａｌＬＤＨ、ＡＡＯ及ＡＰＸ活性的关系，以期了解树莓果实维生素Ｃ积累的生理机制，为高含量维生素Ｃ果树的育种奠定基础。

１材料与方法

１．１试验材料

供试品种为哈瑞太慈（Ｈｅｒｉｔａｇｅ）、撒米特（Ｓｕｍｍｉｔ）、杜拉明（Ｔｕｌａｍｅｅｎ）、费尔杜德（Ｆｅｒｔｏｄ Ｚａｍａｔｏｓ）。各树莓品种种植于黑龙江省农业科学院园艺分院，２０１１年５～１０月采取这４个品种的绿熟期、１／４红熟期、１／２红熟期、３／４红熟期、红熟期果实，取鲜果进行维生素Ｃ含量及各种酶活性的测定。

１．２各指标测定方法

１．２．１ＡｓＡ和ＤＨＡ含量的测定参考Ｔｕｒcｓáｎｙｉ等［４］及Ｔａｋａｈａｍａ等［５］的方法并作适当改进： 取约２ ｇ果实（不去果皮）在５％的偏磷酸中研磨匀浆，４ ℃ １０ ０００ ｒ／ｍｉｎ 离心２０ ｍｉｎ，收集上清液用于测定ＡｓＡ和ＤＨＡ的含量。测定ＡｓＡ时吸取１００ μＬ的上清液加入到２ ｍＬ １００ ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸钾缓冲液（ｐＨ ６．８）中，当加入１ Ｕ的抗坏血酸氧化酶（ＥＣ１．１０．３．３，来自Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｓｐ．）后记录２６５ ｎｍ下的吸光度。测定ＤＨＡ时吸取１００ μＬ上清液加入到２ ｍＬ １００ ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸钾缓冲液（ｐＨ ６．８）中，当加入２ ｍｍｏｌ／Ｌ二硫苏糖醇（ＤＴＴ）后记录２６５ ｎｍ下的吸光度。同时，用一系列已知浓度的ＡｓＡ和ＤＨＡ（Ｓｉｇｍａ公司产品）溶液用相同的方法制作标准曲线以计算样品中ＡｓＡ、ＤＨＡ和ＡｓＡ＋ＤＨＡ（总维生素Ｃ）的含量。

１．２．２酶活性测定

１）ＧａｌＬＤＨ活性测定。酶液的提取参考安华明等［６］的方法。酶活性的测定参考Ｔａｂａｔａ等［７］的方法： ２．４ ｍＬ反应体系中含有２ ｍＬ １．０５ ｍｇ／ｍＬ的细胞色素Ｃ（Ｃｙｔ ｃ）、２００ μＬ ５６ ｍｍｏｌ／Ｌ的Ｌ－半乳糖内酯和２００ μＬ酶提取液。测定前先将反应液混合于２５ ℃温育１ ｍｉｎ，反应从加入Ｌ－半乳糖内酯开始计时， 测定５５０ ｎｍ下的吸光度。１ ｎｍｏｌ／ｍｉｎ Ｌ－半乳糖内酯氧化量（相当于Ｃｙｔ ｃ还原量为２ ｎｍｏｌ／ｍｉｎ）为１个单位（Ｕ）。

２）ＡＰＸ及ＡＡＯ活性测定。采用Ｐｉｇｎｏｃｃｈｉ等［８］的方法：称取约２ ｇ果实在４ ｍＬ含０．３ ｍｏｌ／Ｌ甘露醇、１ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、１％牛血清白蛋白（ＢＳＡ）、０．０５％半胱氨酸及２％ＰＶＰ 的５０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液（ｐＨ ７．２）中冰浴研磨，４ ℃ １２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心２０ ｍｉｎ，收集上清液作为酶液。ＡＰＸ反应液含３ ｍＬ ５０ ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸钾缓冲液（０．０９ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｈ２Ｏ２， ０．０５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＡｓＡ， ｐＨ ７．４）和１００ μＬ的酶液。ＡＡＯ反应液含３ ｍＬ ５０ ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸钾缓冲液（０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ， ０．１５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＡｓＡ， ｐＨ ７．０）和１００ μＬ的酶液。测定２６５ ｎｍ下吸光度的变化。此两种酶的活性定义为：１ μｍｏｌ／ｍｉｎ ＡｓＡ的氧化量为１个单位（Ｕ）。

以上各生理指标的测定均重复３次。

１．３数据统计与分析

试验数据采用ＤＰＳ数据处理系统进行分析。

２结果与分析

２．１树莓果实不同发育时期ＡsＡ、ＤＨＡ和总维生素Ｃ含量的变化

总维生素Ｃ由氧化型（ＤＨＡ）和还原型（ＡsＡ）组成。从图１可以看出，４个品种树莓果实的ＡsＡ和总维生素Ｃ的含量随果实的发育逐渐升高，而ＤＨＡ的含量逐渐降低，总维生素Ｃ和ＡsＡ的含量均在果实红熟期达到最大值，虽然ＤＨＡ的含量在逐渐降低，但是并没有影响ＡsＡ和总维生素Ｃ含量的升高，说明ＤＨＡ的含量只是树莓果实维生素Ｃ库中的极小部分。４个品种中费尔杜德的ＡsＡ含量和维生素Ｃ总含量都最高。

２．２树莓果实不同发育时期ＧａｌＬＤＨ活性的变化

随着树莓果实的不断成熟，ＧａｌＬＤＨ活性也不断上升（图２），ＧａｌＬＤＨ活性与ＡｓＡ和总维生素Ｃ含量的变化趋势基本一致。在绿熟期４个品种的ＧａｌＬＤＨ活性差异不显著，在随后的果实发育时期，费尔杜德果实的ＧａｌＬＤＨ活性与其他３个品种差异显著。相关性分析表明，４个品种中费尔杜德、杜拉明、哈瑞太慈红熟期果实的ＧａｌＬＤＨ活性与ＡｓＡ积累呈极显著正相关，相关系数分别为０．９８４ ５、０．９９０ ４和０．９５２ ６，撒米特的ＧａｌＬＤＨ活性与ＡｓＡ积累呈显著正相关，相关系数为０．８４１ ３。由此可知ＧａｌＬＤＨ活性是决定ＡsＡ水平高低的主要因素之一。

２．３树莓果实不同发育时期ＡＰＸ和ＡＡＯ活性的变化

ＡＰＸ的活性随着ＡｓＡ含量的升高逐渐降低（图３），可能会在一定程度上减少ＡｓＡ的氧化分解，有利于ＡｓＡ的积累。通过相关性分析可知，果实的ＡＰＸ活性与ＡsＡ含量相关不显著，ＡＰＸ变化与ＤＨＡ含量的变化趋势基本一致，杜拉明和撒米特红熟期果实中的ＡＰＸ活性与ＤＨＡ含量呈极显著正相关，相关系数分别为０．９６７ ８、０．９１３ ７，费尔杜德和哈瑞太慈红熟期果实的ＡＰＸ活性与ＤＨＡ含量呈显著正相关，相关系数分别为０．７６７ ８、０．８５６ ７。ＡＡＯ的活性随着果实的成熟先升高后略有降低（图４），ＡＡＯ活性与维生素Ｃ含量的相关性分析结果表明，二者不存在显著相关关系。

３小结与讨论

高等植物ＡｓＡ生物合成和代谢途径被逐渐揭示，特别是明确了ＡｓＡ生物合成的Ｌ－半乳糖途径［３］。Tokunaga等［９］对转正义ＧａｌＬＤＨ基因的烟草进行研究，发现ＧａｌＬＤＨ会过量表达，而且增加了转基因烟草中的ＡｓＡ含量。研究结果表明，ＧａｌＬＤＨ活性与ＡｓＡ积累呈显著正相关，这与以刺梨为试验材料的研究结果基本一致［６］，且此次研究中高ＡｓＡ含量的树莓品种费尔杜德中ＧａｌＬＤＨ活性显著高于其他3个品种，所以认为树莓果实中ＡsＡ含量的差异与ＧａｌＬＤＨ存在密切关系。同时，ＡＰＸ和ＡＡＯ对ＡｓＡ的积累也有不可忽视的作用。通过相关性分析可知，ＡＰＸ活性与ＡｓＡ含量相关不显著，与ＤＨＡ含量呈显著正相关，表明ＡＰＸ是将ＡｓＡ氧化进而形成ＤＨＡ的主要酶。ＡＡＯ的活性随着果实的成熟先升高后略有降低，通过对果实发育各个时期的ＡＡＯ活性与ＡsＡ含量的相关性分析发现，两者相关性不显著。ＡＰＸ和ＡＡＯ在果实发育到３／４红熟期和红熟期时活性很低，因而在这段时期后ＡｓＡ极少氧化分解，这是树莓果实能够积累高水平ＡｓＡ的另一重要原因。这样，一方面ＡｓＡ在持续不断地合成，另一方面其氧化损失很少，从而使维生素Ｃ高水平积累。

虽然研究明确了ＧａｌＬＤH、ＡＰＸ及ＡＡＯ在树莓果实维生素Ｃ积累中的作用，但是植物维生素Ｃ的积累与其合成、代谢、再生及环境等多因素有关，再生循环及环境因素对维生素Ｃ积累的影响也值得进一步研究。

参考文献：

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