球孢白僵菌菌株Ｂｂ－２孢子侵染力和代谢产物毒力

高萍 胡强 王彭

摘要：利用球孢白僵菌菌株Ｂｂ－２（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ ｂａｓｓｉａｎａ Ｂｂ－２）活体孢子和代谢产物对２龄小菜蛾（Ｐｌｕｔeｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）幼虫和桃蚜（Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ）进行毒力测定。结果表明，菌株Ｂｂ－２在１．１×１０７、１．１×１０８、１．１×１０９个孢子／ｍＬ ３个浓度下，对２龄小菜蛾幼虫和桃蚜均表现出较高的侵染力。在高浓度（１．１×１０９个孢子／ｍＬ）条件下，２龄小菜蛾幼虫的４ ｄ累计死亡率为７５.0％，桃蚜的４ ｄ累计死亡率为９２．５％。在低浓度（１．１×１０７个孢子／ｍＬ）条件下，２龄小菜蛾幼虫的４ ｄ累计死亡率为３６．７％，桃蚜的４ ｄ累计死亡率为４７．７％。菌株Ｂｂ－２发酵液对２龄小菜蛾幼虫和桃蚜均有一定的活性，且对桃蚜的活性明显高于对小菜蛾的活性。

关键词：球孢白僵菌菌株Ｂｂ－２（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ ｂａｓｓｉａｎａ Ｂｂ－２）；侵染力；代谢产物

中图分类号：Ｓ４７６．１２；Ｓ４３６．３文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）15－3237-03

Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｏｆ Ｓｐｏｒｅｓ ａｎｄ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｆｉｌｔｒａｔｅｓ ｏｆ Ｂｅａｕｖｅｒｉａ ｂａｓｓｉａｎａ Ｂｂ－２

ＧＡＯ Ｐｉｎｇ，ＨＵ Ｑｉａｎｇ，ＷＡＮＧ Ｐｅｎｇ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， Ｓｈｅｎｙａｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１０１６１， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｏｆ Ｂｅａｕｖｅｒｉａ ｂａｓｓｉａｎａ ｓｔｒａｉｎ Ｂｂ－２ ｔｏ Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ ａｎｄ Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ ｗａｓ ａｓｓａｙｅｄ ｂｙ ｉｔｓ ａｌｉｖｅ ｓｐｏｒｅｓ ａｎｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｆｉｌｔｒａｔｅｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ Ｂｂ－２ ｗａｓ ｈｉｇｈｌｙ ｖｉｒｕｌｅｎｔ ａｔ ｔｈｒｅｅ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｉｅｓ， １．１×１０７，１．１×１０８，１．１×１０９ ind./mL． Ａｔ ｈｉｇｈ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ １．１×１０９ ind./mL， ｔｈｅ ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｏｆ Ｐ. ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ ｗａｓ ７５.0％； ａｎｄ of Ｍ. ｐｅｒｓｉｃａｅ ｗａｓ ９２．５％ in 4 d． Ａｔ ｌｏｗ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ， ｔｈｅ ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｗａｓ ３６．７％； ａｎｄ of Ｍ. ｐｅｒｓｉｃａｅ ｗａｓ ４７．７％． Ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｆｉｌｔｒａｔｅs ｏｆ ｓｔｒａｉｎ Ｂｂ－２ ｗｅｒｅ also with anti-pest active； ａｎｄ ｔｈｅ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ａｇａｉｎｓｔ Ｍ． ｐｅｒｓｉｃａｅ ｗａｓ ｓｔｒｏｎｇｅｒ ｔｈａｎ Ｐ． ｘｙｌｏｓｔｅｌｌｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｂｅａｕｖｅｒｉａ ｂａｓｓｉａｎａ Ｂｂ－２； ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ； ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｆｉｌｔｒａｔｅｓ

小菜蛾（Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）和桃蚜（Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ）是世界性重要害虫，由于发生广、为害重且极易对化学农药产生抗性，对蔬菜生产造成很大的威胁。因此，微生物杀虫剂的开发成为国内外研究的热点，昆虫病原真菌也由于其独特的杀虫作用而日益受到关注［１］。

白僵菌（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ）是当前世界上研究和应用最广泛的一种昆虫病原真菌，在自然界的分布极为广泛，寄主约有１５个目的７００多种昆虫［２］，在国外已被成功开发成为多种剂型农药并登记注册，在害虫的可持续治理中具有重要意义［３，４］。１９９５年美国相继注册登记了２个真菌杀虫剂系列产品，1个是球孢白僵菌，另1个是玫烟色拟青霉，用于防治蚜虫、叶蝉等刺吸式害虫，标志着防治刺吸式害虫的真菌杀虫剂产业化的开始［５］。而我国应用丝孢类虫生真菌防治刺吸式害虫的研究尚处于起步阶段。因而，加快针对刺吸式害虫的真菌杀虫剂的开发，是我们面临的重要机遇和挑战。本试验对分离于桃蚜体上的球孢白僵菌Ｂｂ－２菌株对小菜蛾幼虫和桃蚜的毒力进行了测定，为进一步研究和开发利用该菌株奠定基础。

１材料与方法

１．１供试昆虫与菌株

供试昆虫：小菜蛾（Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）２龄幼虫，由沈阳化工研究院提供，并由本实验室继代饲养；桃蚜（Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ）无翅成蚜，采自沈阳农业大学园艺学院基地温室，采用盆栽白菜苗室内饲养。

供试菌株：球孢白僵菌Ｂｂ－２菌株，原始寄主为桃蚜，于２００６年１０月采自沈阳农业大学园艺学院实验地，经室内保湿，分离纯化获得。

１．２培养基

ＳＤＡＹ培养基（成分：葡萄糖２０ ｇ、蛋白胨１０ ｇ、酵母浸膏１０ ｇ、琼脂２０ ｇ、蒸馏水１ ０００ ｍＬ。）

查氏培养基（成分：蔗糖３０ ｇ、ＮａＮＯ３ ２ ｇ、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．５ ｇ、蛋白胨５ ｇ、ＫＣｌ ０．５ ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ １ ｇ、ＦｅＳＯ４ ０．０１ ｇ、蒸馏水１ ０００ ｍＬ）

１．３毒力测定

１．３．１菌株Ｂｂ－２孢子侵染力测定

１）菌液的制备。将菌种Ｂｂ－２接种于ＳＤＡＹ培养基上，在２５ ℃培养１５ ｄ。用含０．１％Ｔｗｅｅｎ－８０的无菌水分两次加入试管中冲洗，用接种针轻轻刮下培养斜面上的孢子，倒入灭过菌的小烧杯中，然后用无菌水倍比稀释配成１．１×１０７、１．１×１０８、１．１×１０９个孢子／ｍＬ的孢子悬浮液。

２）小菜蛾接种方法。用打孔器将新鲜的白菜叶片打成直径５ ｃｍ左右的圆片，置于底部垫有滤纸片的培养皿中，每皿３片。采用浸渍法将２龄小菜蛾幼虫处理后接入保湿的培养皿中，每皿３０头。每个处理设３个重复，以浸渍含有０．１％ Ｔｗｅｅｎ－８０无菌水的处理作对照。处理后放入恒温培养箱在（２５±１） ℃、相对湿度（８５±５）％条件下培养，每天换一次叶片，每日记录死、活虫数，９６ ｈ后统计校正死亡率。虫死后保湿培养，观察菌丝生长及产孢情况。并挑片镜检确认是否为白僵菌感染致死［６-8］。

３）桃蚜接种方法。将有蚜虫的白菜叶片浸入孢子悬液中，浸渍３ ｓ。用吸水纸吸去多余的水分。除去死蚜虫及过大或过小的蚜虫，保留个体一致的活成蚜，放入保湿的培养皿中，用白菜叶片饲养。每个处理３次重复，每个重复４０头蚜虫，用含０．１％ Ｔｗｅｅｎ－８０的无菌水处理作对照。放入（２５±１）℃、相对湿度（８５±５）％的培养箱中培养。每天定时观察，及时将蚜尸和若蚜移出，记录死、活虫数，７２ ｈ后统计校正死亡率。虫死后保湿培养，观察菌丝生长及产孢情况。并挑片镜检确认是否为白僵菌感染致死［6-8］。

１．３．２菌株Ｂｂ－２代谢产物侵染力测定

１）菌株Ｂｂ－２次级代谢产物的制备。将菌株Ｂｂ－２接种至已灭菌的查氏培养基中， ２５ ℃液体摇瓶发酵培养７ ｄ。发酵液抽滤出菌丝后，将发酵液置于４ ℃冰箱中保存备用。

２）对小菜蛾的毒力测定方法。将新鲜的白菜叶片洗净，用打孔器打成圆叶片，每一圆叶片上点一滴发酵液，与另一片未滴发酵液的叶片对贴，贴上后就不要再移动。每头幼虫一片夹毒叶片放在指形瓶中饲养，用脱脂棉封口。每个处理３０头幼虫，重复３次。以滴加蒸馏水的叶片为对照。处理后于培养箱内在（２５±１）℃、相对湿度（８５±５）％条件下培养，分别于２４、４８ ｈ记录死、活虫数，统计校正死亡率。

３）对桃蚜的毒力测定方法。将有蚜虫的白菜叶片浸入发酵液中，浸渍３ ｓ。用吸水纸吸去多余的水分。除去死蚜虫及过大或过小的蚜虫，保留个体一致的活成蚜，放入垫有滤纸片的培养皿中，用白菜叶片饲养。每个处理３次重复，每个重复３０头蚜虫。用蒸馏水处理作对照。放入（２５±１）℃、相对湿度（８５±５）％的培养箱中培养。每天定时观察，及时将蚜尸和若蚜移出，记录死、活虫数，统计校正死亡率［9］。

２结果与分析

２．１菌株Ｂｂ－２孢子侵染力测定结果

２．１．１昆虫被侵染后的症状被侵染后的小菜蛾幼虫虫体初期虫体膨大变色，然后变僵，之后僵虫体外出现白色菌丝体，渐渐整个虫体会被乳白色的分生孢子粉包裹。被侵染的桃蚜初期身体膨大，然后变僵硬。体表最先出现白色菌丝体，之后除触角、肢体末端之外的整个虫体被白色的粉状物即分生孢子覆盖。最后虫体被菌丝体和分生孢子完全覆盖。

２．１．２孢子侵染力测定结果在２５ ℃条件下，采用１．１×１０７、１．１×１０８、１．１×１０９个孢子／ｍＬ ３个浓度的孢子悬浮液测定菌株Ｂｂ－２对小菜蛾幼虫和桃蚜的侵染力。根据试验所得数据，用ＤＰＳ软件进行统计分析。从图１、图２中可以看出，菌株Ｂｂ－２对小菜蛾幼虫和桃蚜均表现出致病力，但对桃蚜的致病力要明显高于对小菜蛾幼虫的致病力。在高浓度（１．１×１０９个孢子／ｍＬ）条件下，小菜蛾２龄幼虫的死亡率为７５．０％，而桃蚜的死亡率高达９２．５％；在低浓度条件下，小菜蛾２龄幼虫的死亡率为３６．７％，桃蚜的死亡率为４７．７％。随着接种孢子浓度的增加，菌株Ｂｂ－２对小菜蛾和桃蚜的致病力增强，但对不同昆虫致病力增长的幅度不一致。

２．２菌株Ｂｂ－２次级代谢产物毒力测定结果

试验结果（图３）表明，真菌菌株Ｂｂ－２发酵液对２龄小菜蛾幼虫和桃蚜成蚜均有一定的活性，对桃蚜活性明显高于对小菜蛾的活性。２４ ｈ桃蚜校正死亡率为６１．１％，而２龄小菜蛾幼虫校正死亡率仅为２６．７％；４８ ｈ桃蚜校正死亡率上升为７９．６％，而２龄小菜蛾幼虫校正死亡率为３５．６％。发酵液对同种昆虫的活性也不尽相同，随着时间的增加，桃蚜的死亡率也在增加，２４ ｈ桃蚜大量死亡，４８ ｈ校正死亡率达到７９．６％。而２龄小菜蛾幼虫死亡率随时间的增加变化不明显，２４ ｈ的校正死亡率为２６．７％，４８ ｈ的校正死亡率为３５．６％。

３结论与讨论

本次试验测定了球孢白僵菌菌株Ｂｂ－２不同浓度孢子悬浮液及其次生代谢产物对２龄小菜蛾幼虫和桃蚜的毒力。结果表明，无论孢子悬浮液还是次生代谢产物对桃蚜的毒力均要明显高于对２龄小菜蛾幼虫的毒力。孢子悬浮液侵染力测定结果表明，在２５ ℃条件下，采用１．１×１０７、１．１×１０８、１．１×１０９个孢子／ｍＬ ３个浓度的孢子悬浮液对２龄小菜蛾幼虫和桃蚜成蚜均表现出致病力。随着接种孢子浓度的增加，菌株Ｂｂ－２对小菜蛾和桃蚜的致病力增强。在高浓度（１．１×１０９个孢子／ｍＬ）条件下，小菜蛾２龄幼虫的死亡率为７５．０％，而桃蚜的死亡率高达９２．５％；在低浓度条件下，小菜蛾２龄幼虫的死亡率为３６．７％，桃蚜的死亡率为４７．７％。次级代谢产物毒力测定结果表明，真菌菌株Ｂｂ－２发酵液对２龄小菜蛾幼虫和桃蚜均有一定的活性，对桃蚜活性明显高于对小菜蛾的活性。２４ ｈ桃蚜校正死亡率为６１．１％，而２龄小菜蛾幼虫仅为２６．７％。４８ ｈ桃蚜校正死亡率上升为７９．６％，而２龄小菜蛾幼虫校正死亡率为３５．６％。

蚜虫不仅吸食植物汁液，引起植物营养恶化，而且是许多植物病毒的传毒媒介，应用现代生物技术开发和研制生物杀虫剂，控制蚜虫的发生与为害，具有重大意义。本研究中应用的球孢白僵菌Ｂｂ－２菌株无论活体孢子还是次级代谢产物对桃蚜均具有较高的毒力，说明该菌株具有一定的应用潜力，值得进一步研究。

参考文献：

［１］ 周传恩．我国杀虫微生物的应用研究进展及发展前景［Ｊ］．农药，２００１，４０（７）：８－１０．

［２］ 张继祖，徐金汉．中国南方地下害虫及其天敌［Ｍ］．北京：中国农业出版社，１９９６．１５２－１５３．

［３］ 何余容，吕利华，邝灼彬，等．球孢白僵菌不同分离株的生物学及对小猿叶甲成虫致病性测定［Ｊ］．昆虫知识，２００４，４１（５）：４４２－４４５．

［４］ 何恒果，李正跃，陈斌，等．侵染马铃薯块茎蛾幼虫的球孢白僵菌对桃蚜的毒力测定［Ｊ］．农药，２００４，４３（１）：２２－２４．

［５］ 冯明光，徐均焕，屠国兴．杀虫真菌制剂的开发与应用前景［Ｊ］．杭州科技，１９９９，２０（４）：１９－２１．

［６］ 孙鲁娟，吴孔明，郭予元．不同温、湿度下白僵菌对棉铃虫幼虫的致病力［Ｊ］．昆虫学报，２００１，４４（４）：５０１－５０６．

［７］ 何恒果，李正跃．球孢白僵菌4菌株对桃蚜的控制效果研究［Ｊ］．吉林农业大学学报，２００6，28（1）：13－17．

［8］ 单乐天，冯明光．不同寄主及地理来源的１６株绿僵菌对桃蚜的毒力比较［Ｊ］．微生物学报，２００６，４６（４）：６０２－６０７．

［9］ 戴美学，祖爱民．灰绿拟青霉Ｕ－２发酵液杀蚜活性物质的分离提取［Ｊ］．生物技术，１９９７（３）：３２－３４．