Ｄ型产气荚膜梭菌青海分离株ε毒素遗传变异分析

冶贵生

摘要：研究Ｄ型产气荚膜梭菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）青海分离株ε毒素基因的遗传变异特点，试验设计特异性引物扩增ε毒素基因，目的基因片段大小为８８８ ｂｐ。建立ＰＣＲ反应体系并设置反应条件，扩增产物进行电泳检测、纯化、测定核苷酸序列，与参考序列进行同源比对分析。结果表明，目的基因扩增良好，分离菌株ＷＣ－ｅｐｓｉｌｏｎ－ＦＬ与菌株Ｃ６０－３、ＮＣＴＣ ８３４６、Ｍｕｋｔｅｓｈｗａｒ、ＡＪ２５０９５６的核苷酸序列的同源性依次为９９．９％、９９．８％、９８．９％、９９．４％。

关键词：Ｄ型产气荚膜梭菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）；ε毒素；遗传变异

中图分类号：Ｓ８５２文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）15－3183-03

Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｏｆ ε Ｔｏｘｉｎ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ Ｔｙｐｅ Ｄ Iｓｏｌａｔｅｄ from Ｑｉｎｇｈａｉ

ＹＥ Ｇｕｉ－ｓｈｅｎｇ

（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ， Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ａｎｉｍａｌ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ， Ｑｉｎｇｈａｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｘｉｎｉｎｇ ８１００１６，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｏｆ ε ｔｏｘｉｎ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ ｔｙｐｅ Ｄ isolated from Qinghai，ｐｒｉｍｅｒｓ of which PCR product length was 888 bp was designed ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ε ｔｏｘｉｎ ｇｅｎｅ． Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ was ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ； ｔｈｅｎ its ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｗｉｔｈ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ was analyzed． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｏｘｉｎ ｇｅｎｅ ｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｖｅｒｙ ｗｅｌｌ， ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｒａｔｅ was ９９．９％、９９．８％、９８．９％、９９．４％ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｑｉｎｇｈａｉ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ ｓｔｒａｉｎ Ｃ６０－３， ｓｔｒａｉｎ ＮＣＴＣ ８３４６， ｓｔｒａｉｎ Ｍｕｋｔｅｓｈｗａｒ， ｓｔｒａｉｎ ＡＪ２５０９５６ ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ ｔｙｐｅ Ｄ； ε ｔｏｘｉｎ； ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ

产气荚膜梭菌又称魏氏梭菌，是一种人畜共患病的革兰氏阳性菌，产芽胞，在自然界分布极广，土壤、饲料、蔬菜等均有分布。产气荚膜梭菌分型较多，其中Ｄ型产气荚膜梭菌严重危害养羊业，其引起的疾病为羊肠毒血症，该病潜伏期短，发病快，死亡快［１］。Ｄ型产气荚膜梭菌主要产生α和ε两种毒素，其中α毒素具有磷脂酶的活性［２］，ε毒素前体被激活后会对细胞产生毒性并增加血管渗透性［３］。青海地处青藏高原，是我国重要的牧区之一，绵羊养殖业在青海牧区养殖业中所占比重较大，鉴于产气荚膜梭菌的致病特点，该菌对青海省养羊业构成一定程度的威胁，因此，本研究通过测定并分析Ｄ型产气荚膜梭菌青海分离株ε毒素基因的核苷酸变异特点，旨在为青海省产气荚膜梭菌病的防治提供基础依据。

１材料与方法

１．１材料

１．１．１菌株Ｄ型产气荚膜梭菌为临床分离并保存于青海大学农牧学院预防兽医学实验室。

１．１．２试剂Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶为宝生物（大连）有限公司产品，细菌基因组提取试剂盒为天根生化科技（北京）有限公司产品、ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ为宝生物（大连）有限公司产品，硫乙醇酸盐流体培养基为北京路桥技术有限责任公司产品。

１．１．３引物根据ＮＣＢＩ上登录的产气荚膜梭菌ε毒素基因序列设计特异性引物，预期目的片段大小为８８８ ｂｐ。上游引物：５′－ＡＡＧＧＡＡＡＴＡＴＣＴＡＡＴＡＣＡＧＴＡＴＣＴＡＡＴＧ－３′；下游引物：５′－ＴＴＴＴＡＴＴＣＣＴ

ＧＧＴＧＣＣＴＴ－３′。

１．２方法

１．２．１增菌培养按培养基说明书配制，无菌操作进行产气荚膜梭菌的厌氧培养。

１．２．２ＤＮＡ提取参照细菌基因组提取试剂盒说明书进行。

１．２．３毒素基因的ＰＣＲ扩增反应体系：Ｂｕｆｆｅｒ ５ μＬ、ｄＮＴＰ ４ μＬ、上游引物 １ μＬ、下游引物 １ μＬ、模板 １ μＬ，Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶 ０．５ μＬ、补灭菌水至５０ μＬ。反应条件：９４ ℃ １ ｍｉｎ、４７ ℃ １ ｍｉｎ、７２ ℃ １ ｍｉｎ，３５个循环，然后７２ ℃ １０ ｍｉｎ，４ ℃ 保存。

１．２．４扩增结果检测扩增结束后取５ μＬ扩增产物进行１％琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果。

１．２．５序列分析将扩增产物纯化后测序并进行同源性分析。

２结果与分析

２．１ε毒素基因ＰＣＲ扩增检测

ε毒素基因所在泳道２出现目的条带，目的基因条带清晰，表明扩增效果良好（图１）。

２．２ε毒素基因核苷酸序列分析

应用ＤＮＡｓｔａｒ软件对所测菌株ε毒素基因核苷酸进行分析，结果表明（表1）所测青海分离株ε毒素基因Ａ＋Ｔ含量较高，其碱基组成含有较多的腺嘌呤和胸腺嘧啶。

２．３ε毒素基因核苷酸序列同源性分析

选择ＮＣＢＩ登录的４株Ｄ型产气荚膜梭菌（菌株Ｃ６０－３、ＮＣＴＣ ８３４６、Ｍｕｋｔｅｓｈｗａｒ、ＡＪ２５０９５６）的ε毒素基因与所测青海分离菌株ＷＣ－ｅｐｓｉｌｏｎ－ＦＬ进行同源比对分析。比对结果表明，菌株ＷＣ－ｅｐｓｉｌｏｎ－ＦＬ的ε毒素基因与参考菌株核苷酸序列同源性依次为９９．９％、９９．８％、９８．９％、９９．４％（图２），所测菌株与菌株 Ｃ６０－３之间有１处核苷酸突变；与菌株 ＮＣＴＣ ８３４６之间有２处核苷酸突变；与菌株Ｍｕｋｔｅｓｈｗａｒ之间有５处核苷酸突变；与菌株ＡＪ２５０９５６有２处核苷酸突变（图３）。

３讨论

Ｄ型产气荚膜梭菌可产生α和ε两种毒素，毒素是该菌致病的主要因素，ε毒素编码基因位于细菌大质粒上，当细菌侵入宿主体内后ε毒素以前体形式被分泌出来，在肠道内毒素前体的Ｎ端和Ｃ端部分氨基酸被肠道内的蛋白酶切除后转变成有活性的毒素，从而造成机体组织器官的损伤。ε毒素可与细胞膜上的受体结合并在膜上形成孔隙从而造成细胞内外离子浓度的变化，进而引起细胞死亡。本研究所测Ｄ型产气荚膜梭菌青海分离株ε毒素基因长度为８８８ bp，从ε毒素基因序列同源性分析结果来看，菌株ＷＣ－ｅｐｓｉｌｏｎ－ＦＬ与菌株Ｃ６０－３亲缘关系最近；与菌株ＮＣＴＣ ８３４６和菌株 ＡＪ２５０９５６的亲缘关系次之；与菌株 Ｍｕｋｔｅｓｈｗａｒ亲缘关系最远。另外，从ε毒素基因序列同源性比对结果可知，菌株ＷＣ－ｅｐｓｉｌｏｎ－ＦＬ与菌株Ｃ６０－３之间１处的核苷酸突变，为Ｃ－Ａ突变；与菌株ＮＣＴＣ ８３４６之间的２处核苷酸突变，均为Ｃ－Ａ突变；与菌株Ｍｕｋｔｅｓｈｗａｒ之间的５处核苷酸突变，分别为2处Ｔ－Ｇ突变、１处Ｔ－Ａ突变、１处Ｇ－Ａ突变和１处Ａ－Ｔ突变；与菌株ＡＪ２５０９５６的２处突变为Ｇ－Ａ突变和Ａ－Ｔ突变，上述突变均为点突变，这说明Ｄ型产气荚膜梭菌可通过ε毒素基因的变异来适应不同的地域环境，通过遗传变异加强自身适应不同生存环境的能力。

参考文献：

［１］ 陈敷言．兽医传染病学［Ｍ］． 第五版．北京，中国农业出版社，２００６．３１５－３１６．

［２］ ＲＯＯＤ Ｊ Ｉ，ＭＣＣＬＡＮＥ Ｂ Ａ，ＳＯＮＧＥＲ Ｊ Ｇ，ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ Ｃｌｏｓｒｒｉｄｉａ： Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ［Ｍ］． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９７.２２３－２４２．

［３］ ＭＩＹＡＬＭＯＴＯ Ｏ， ＭＩＮＡＭＩ Ｊ， ＴＯＹＯＳＨＩＭＡ Ｔ， ｅｔ ａｌ． Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ ｅｐｓｉｌｏｎ ｔｏｘｉｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｔ ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ ｖｉａ ｔｈｅ ｇｌｕｔａｍａｔｅｒｇｉｃ ｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ， １９９８，６６（6）：２５０１－２５０８．