生肌玉红明胶海绵生肌作用机理的实验研究

高卫卫

(徐州医学院附属医院 肛肠科，江苏 徐州 221000)

生肌玉红膏具有祛腐生肌之功效，临床应用广泛，实验研究亦发现其具有促进创面微循环、血管新生、肉芽生长、胶原合成、上皮生长及调控局部成纤维细胞生长因子水平等作用。明胶海绵作为止血的体内植入药物长期运用于临床，安全性高，无毒副作用，其主要成分是胶原，经过修饰后可以提高组织相容性及促进血管生成。我们前期[1]对生肌玉红膏载入修饰后明胶海绵发现其促进创面肉芽生长的机理之一是促进血管生成及改善创面微循环。本文将观察生肌玉红明胶海绵对创面愈合率、肉芽组织中bGFG阳性细胞数、Ⅰ、Ⅲ胶原含量、羟脯氨酸含量的影响，进一步探讨其生肌作用机理。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器 明胶海绵；生肌玉红纱布；凡士林纱布；即用型快速免疫组化MaxVisionTM试剂盒；DAB显色试剂；CollagenⅠ、CollagenⅢ；b-FGF试剂盒；羟脯氨酸测试盒；756PA紫外可见光光度计；光学显微镜等。

1.2 药物来源及制剂加工 生肌玉红明胶海绵的制备流程:以生肌玉红膏主要药物组成(当归、紫草、血竭、白腊、白芷、甘草，去除轻粉 )20 g剂量均匀搅拌于肝素修饰后的明胶海绵胶原中，接着行低温(-20 ℃)冻干形成生肌玉红明胶海绵。

生肌玉红明胶海绵消毒：制作好的生肌玉红明胶海绵装玻璃器皿密封后，予钴60-γ射线辐照，每周消毒1次，辐照标准参照1997年卫生部发布《60Co中药灭菌标准》(江苏省农业科学院原子能研究所提供)。

1.3 动物分组及给药 实验动物及造模方法：选取SD大鼠40只(200～250 g)雌雄各半，参照付小兵全层皮肤缺损法制成动物体表溃疡模型。实验分组及给药方法:将大鼠随机分为4组:凡士林对照组(F组)10只、生肌玉红膏组(S组)10只、修饰后明胶海绵组(M组)10只、生肌玉红明胶海绵组(SM组)10只。创伤模型制成后，医用碘伏消毒创面,在F组大鼠的创面上敷凡士林纱条并用无菌敷料包扎创面；S组大鼠的创面上敷生肌玉红膏后再予无菌敷料包扎创面；M组大鼠的创面上敷明胶海绵后再用无菌敷料包扎创面；SM组大鼠的创面上敷生肌玉红明胶海绵后再予无菌敷料包扎创面。每组均为隔日换药1次。

1.4 观察指标与检测方法

1.4.1 大体指标 创面愈合率:造模后第3、7、14天用数码相机对创面照相，拍摄时镜面与创面保持平行，镜面距创面约15 cm,并在创面边缘放一刻度尺，拍照后将照片存入电脑，记录拍照日期及分组情况，用Image J软件利用测定像素比例测出创面面积。

1.4.2 病理指标 Ⅰ、Ⅲ胶原含量、bFGF阳性细胞数:取造模后第3、7、14天创面中心肉芽组织，石蜡固定后，与创面肉芽平行方向切片,行HE染色后，采用MaxVisionTM即用型快速免疫组化一步法测定。

Ⅰ、Ⅲ胶原以有棕黄色染者为阳性对照，PBS代替一抗做阴性对照，染色结果应用Image2 Pro Plus 4.1版本计算机图像分析系统在显微镜下计算区域的阳性面积百分比(%)，求出5个视野平均值，实验结果以细胞及基质显色面积为标准。

bFGF免疫组化标记定位于细胞浆，以细胞浆着色呈棕黄色为阳性细胞。目镜为10倍，物镜为20倍的条件下，采用双盲法，由2个观察者对各组标本每个切片随机选取5个视野，计数阳性细胞数及总细胞数，并计算阳性细胞率。

1.4.3 生化指标 羟脯氨酸含量:采用样本碱水解法，将创面肉芽取出称重后，予以匀浆后离心，加入试剂后，以分光光度仪测定其吸收值。

2 结果

2.1 各组创面愈合率比较 见表1。

表1 各组创面不同时间愈合率(±s) %

2.2 bFGF免疫组化标记结果 见图1，图2。

注:柱状图形为各组创面肉芽内bFGF阳性细胞百分比的均数，误差线为各组标准差(下同)。与凡士林组比较，#P<0.05或0.01；与生肌玉红膏组比较，△P<0.05或0.01。

图2 大鼠肉芽第7天bFGF免疫组化照片(×200倍)

2.3 大鼠创面肉芽中Ⅰ型胶原结果 见图3，图4。

注：与凡士林组比较，#P<0.05或0.01;与生肌玉红膏组比较，△P<0.05或0.01。

图4 大鼠肉芽第7天Ⅰ型胶原免疫组化照片(×200倍)

2.4 创面肉芽中Ⅲ型胶原含量 见图5，图6。

注:与凡士林组比较，#P<0.05或0.01；与生肌玉红膏组比较，△P<0.05或0.01。

图6 大鼠肉芽第14天Ⅲ型胶原免疫组化照片(×100倍)

2.5 各组创面肉芽内羟脯氨酸含量 见表2。

表2 各组创面肉芽组织中羟脯氨酸含量(±s) μg/mg

3 讨论

胶原，尤其是Ⅰ型胶原，是生物体各种结缔组织的主要组成，具有促进组织愈合、可体内降解且降解碎片具有组织相容性的特性，同时经过修饰后可以提高组织相容性及促进血管生成，已成为组织工程中应用最广的生物材料[2]。明胶是胶原经温和断裂后的产物，它与胶原具有相同的化学组成，保留了胶原大部分的优良理化性能。

通过将生肌玉红膏载入修饰后明胶海绵，明胶海绵中的肝素随着明胶的降解进入创面，与组织中的促血管生成生长因子发生生理性结合，提高其促血管生成的疗效[3]，新生的血管为纤维的包裹提供了良好的支架，同时为肉芽的生长提供了良好的血运。造模后第3、7天，各组bFGF含量均呈逐渐上升的趋势，实验组bFGF阳性细胞数显著高于控制组，而生肌玉红明胶海绵组显著高于生肌玉红膏组及明胶海绵组。内源性bFGF表达增加，不仅可通过趋化作用使单核细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、成纤维细胞等向损伤部位聚集，减轻炎症反应，同时能促进血管和肉芽组织的生成，促进软组织和骨组织中各种与损伤修复重建有关的细胞分裂增殖[4]。因此在创伤修复炎症期及增殖期，经肝素修饰后的明胶海绵能刺激血管生成，加速肉芽的生长，其疗效和生肌玉红膏相似，生肌玉红明胶海绵的疗效又好于二者。造模后第14天，各组bFGF含量下降，且生肌玉红明胶海绵组及生肌玉红膏组显著低于对照组。既往研究[1，5]结果显示：生肌玉红明胶海绵在创伤初期肉芽内VEGF含量升高，而后期VEGF含量稍下降；生肌玉红膏能在创伤修复各期调节局部组织中成纤维细胞生长因子，均与本次实验结果一致。

在创面愈合过程中，Ⅰ、Ⅲ型胶原起着重要作用[6]。Ⅲ型胶原比例高低与瘢痕的形成及质量好坏密切相关。创伤形成后，纤维细胞增生，促进纤维形成，以填补组织缺损，因此造模后第3、7天，实验各组Ⅰ、Ⅲ型胶原均显著增生，Ⅰ型胶原以生肌玉红明胶海绵增生显著，高于其他2个实验组；而Ⅲ型胶原作为新生胶原，增生活跃，故各组第3天无统计学差异，而第7天各实验组与控制组达到显著差异。在创伤修复塑性期,生肌玉红明胶海绵组Ⅰ型胶原稍下降，而Ⅲ型胶原含量仍维持较高水平，这对于降低Ⅰ、Ⅲ胶原比例，减少瘢痕的形成，提高创伤修复质量有重要意义。

羟脯氨酸(OHP)多见于胶原内,是胶原蛋白的主要而恒定的成分，一般以羟脯氨酸含量的7.46倍代表胶原的量[7]，因此，通过测定OHP的含量可间接反应胶原的含量,了解创面愈合过程中胶原代谢状况。造模后，各组创面肉芽中羟脯氨酸含量逐渐升高，至第14天达到峰值，且生肌玉红明胶海绵组羟脯氨酸含量在各期均显著高于控制组，第14天时与生肌玉红膏组达到显著性差异，说明生肌玉红明胶海绵在促进胶原合成方面优于生肌玉红膏，能快速填补组织缺损，提高愈合率。

总之，通过本实验，我们认为，生肌玉红明胶海绵生肌作用的机理主要是通过bFGF介导的。胶原的更新过程主要依赖胶原酶的作用，胶原酶主要是成纤维细胞产生，而bFGF正是成纤维细胞的趋向剂和有力的生长刺激剂。创伤初期，生肌玉红明胶海绵通过提高创面内源性bFGF含量，促进血管新生，趋化炎性细胞减轻炎症反应，刺激成纤维细胞增生、合成纤维和基质，增生的毛细血管、纤维和基质共同形成肉芽组织，填充缺损，有利于周围上皮组织的爬行，促进创面愈合。在创面塑性期，通过下调bFGF水平，促进过度增生胶原降解，使其排列有序，减少瘢痕形成。而生肌玉红明胶海绵的多孔特性，使其具有良好的亲水性，敷于创面后吸湿性好，及时排出创面渗出，也为肉芽的生长提供了良好的环境。

[1]姚昶,孙海舰,姚涌晖,等.生肌玉红明胶海绵促进机械性创面肉芽生长的实验研究[J].医学研究杂志,2009,38(5):62-65.

[2]HUTMACHER D L,HURZELER M B.A tissue engineered cell-occlusive device for hard tissue regeneration--a preliminary report[J].The International Journal of Periodontics & Restorative Dentistry,2001,21:49-59.

[3]YAO C,NOAH E M,STEFFENS G M,et al.The effect of crosslinking of collagen matrices on their angiogenic capability[J].Biomaterials,2008(29):66-74.

[4]CHUA K-h,AMINUDDIN B S,FUZINA N H,et al.Basic fibroblast growth factor with human serum supplementation:enhancement of human chondrocyte proliferation and promotion of cartilage regeneration[J].Singapore Medical Journal,2007,48(4):324-332.

[5]姚昶,潘立群.生肌玉红膏对创面碱性成纤维生长因子含量影响的实验研究[J].江苏中医,1999,20(8):42.

[6]VISHWANATH M,MA Lisha,OTEY C A,et al.Modulation of corneal fibroblast contractility within fibrillar collagen matrices[J].Investigative Ophthalmology & Visual Science,2003,44(11):4724-4735.

[7]李震,李祝,房秋寒,等.中药抗皮肤衰老剂对小鼠皮肤羟脯氨酸含量的影响[J].山东中医药大学学报,1997,21(2):142-143.