光叶娃儿藤镇痛抗炎作用的实验研究

杨超燕 陈艳芬 陶曙红 唐春萍 崔红花

广东药学院中药学院，广东 广州 510006

光叶娃儿藤为萝藦科 (Asclepiadaceac)娃儿藤属(Tylophora)的多年生匍匐性藤状草本植物，主要分布于台湾和广东［1］，在民间广泛应用于治疗感冒发热，咽喉肿痛等，且疗效显著。但目前国内外尚未见其药理作用报道。本研究根据光叶娃儿藤的临床主治，分别采用小鼠热板法、醋酸致扭体法和甲醛致痛法，观察其镇痛作用;用二甲苯所致小鼠耳廓肿胀法及甲醛致小鼠足跖肿胀法观察其抗炎作用。为本品在应用上呼吸道感染疾病的应用提供实验依据。

1 试验材料

1.1 药材

光叶娃儿藤全草采于广东吴川，经中国科学院华南植物研究所标本馆叶华谷研究员鉴定为萝藦科娃儿藤属的光叶娃儿藤 (Tylophora ovata(Lindl.)Hook.ex Steud.var.brownii(Hay.)Tsiang et P.T.Li)，标本存放于中国科学院华南植物研究所标本馆。

1.2 药品及试剂

称取光叶娃儿藤鲜品200 g，切段，置烧杯中加入大约10倍体积的水煎煮3次，每次0.5 h，提取液合并过滤、浓缩光叶娃儿藤水提取物浓缩液 (相当于2.4 g生药/mL)，给药前配成所需浓度;冰醋酸 (分析纯，天津市富宇精细化工有限公司，批号:110920);甲醇 (分析纯，天津市百世化工有限公司，批号:20100630);甲醛 (广州市化学试剂厂，批号:20120204－1);二甲苯 (广州市化学试剂厂，批号:0509071);氢氧化钾 (天津市福晨化学试剂厂，批号:20120210);罗通定片 (四川康福来药业集团有限公司，批号:100301);吲哚美辛片 (广东华南药业有限公司，批号:110601);羧甲基纤维素钠 (天津市百世化工有限公司，批号:20100908)。

1.3 动物

SPF级NIH小鼠，由广东省医学实验动物中心提供，生产许可证号:SCXK(粤)2008－0002，正常饲养3 d后供试。

1.4 仪器

UV－1800紫外分光光度计 (北京瑞利分析仪器公司);AY－120电子分析天平 (岛津仪器公司)。

2 方法

2.1 镇痛作用

2.1.1 对小鼠热板痛阈值的影响［2］

以55±0.5℃热板筛选痛阈值在5－30 s的雌性小鼠，随机分成4组:正常对照组，罗通定阳性组，光叶娃儿藤高、低剂量组。每组每天ig相应的药物，灌胃容积20 mL/Kg，对照组给予等容量的生理盐水，连续给药7天。末次给药后1、2h测量各组小鼠的痛阈值 (若60s内无痛觉反应，按60s计算)。

2.1.2 对醋酸所致小鼠扭体实验的影响［3］

取NIH小鼠48只，雌雄各半，随机分成4组:正常对照组，引哚美辛阳性组，光叶娃儿藤高、低剂量组。每组每天ig相应的药物，灌胃容积20 mL/Kg，对照组给予等容量的生理盐水，连续给药7天。于末次给药后1 h，各小鼠分别腹腔注射0.7%冰醋酸0.2 mL/只，观察并计记录15 min内的扭体次数。

2.1.3 对小鼠甲醛致痛实验的影响［4］

取NIH小鼠48只，雌雄各半，随机分成4组:正常对照组，引哚美辛阳性组，光叶娃儿藤高、低剂量组。每组每天ig相应的药物，灌胃容积20 mL/Kg，对照组给予等容量的生理盐水，连续给药7天。于末次给药后1 h，用2.5%甲醛生理盐水溶液50 uL/只皮下注射小鼠右后足键膜下(从后肢足掌心向踝关节方向进针，皮下给药)，置大烧杯中，分别记录注射后0～10 min(第Ⅰ时相)和15～30 min(第Ⅱ时相)两个时间段小鼠累计舔足时间。

2.2 抗炎作用

2.2.1 对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响［5］

取NIH小鼠48只，雄性，随机分成4组:正常对照组，引哚美辛阳性组，光叶娃儿藤高、低剂量组。每组每天ig相应的药物，灌胃容积20 mL/Kg，对照组给予等容量的生理盐水，各实验组连续给药7天，于末次给药后1 h，在小鼠右耳背腹两侧均匀涂布二甲苯50μL致炎，30 min后脱臼处死，沿耳廓基线剪下两耳，取样用直径为6 mm的不锈钢打孔器，分别在左、右耳同一部位打下圆耳片，精密称重，以左、右耳片重量之差作为肿胀度。

2.2.2 甲醛致小鼠足肿及组织中PGE2含量测定实验［6］

取NIH小鼠48只，雄性，随机分成4组:正常对照组，引哚美辛阳性组，光叶娃儿藤高、低剂量组。每组每天ig相应的药物，灌胃容积20 mL/Kg，对照组给予等容量的生理盐水，连续给药7天。末次给药后1h，各小鼠右后足跖皮下注射2.5%甲醛生理盐水溶液50μL/只，1 h后处死，从踝关节处对称剪下左右后足，精密电子天平称量，计算肿胀度 (mg)。取已称重的右后足，剪碎，加入生理盐水5 mL浸泡1 h，离心浸泡液15 min(3 000 r·min－1)，取上清液0.5 mL，加入0.5 mol/L KOH甲醇液2 mL，在50℃水浴中异构化20 min，加入甲醇稀释至5 mL后，用紫外分光光度计在278 nm处测定吸光度值。按下式计算PGE2含量 (ug/g)。PGE2(ug/g)=A278×13.13 ×D ×V/炎足爪重 (V－PGE2溶液体积、D稀释倍数，其中，V=5 mL、D=10);肿胀度 (mg)=右足重 (mg)－左足重(mg)。

3 统计学处理

计量资料以 (x±SD)表示，采用SPSS 13.0软件，组间显著性差异用方差分析，以P＜0.05为有统计学意义。

4 结果

4.1 镇痛作用

4.1.1 对小鼠热板痛阈值的影响

和对照组比较，光叶娃儿藤高和低剂量组在药后1h和2h都不能显著延长小鼠热板痛阈值，没有显著性差异。结果见表1。

表1 光叶娃儿藤对小鼠热板痛阈值的影响 (x±SD，n=12)

4.1.2 对醋酸所致小鼠扭体实验的影响

和对照组比较，光叶娃儿藤高剂量组小鼠扭体次数明显少于生理盐水对照组，差异有显著性意义 (P＜0.05)。结果见表2。

表2 光叶娃儿藤对醋酸所致小鼠扭体实验的影响 (x±SD，n=12)

4.1.3 对小鼠甲醛致痛实验的影响

和对照组比较，光叶娃儿藤高剂量组对甲醛引起疼痛的第二时相有显著镇痛作用 (P＜0.01)，低剂量组作用不明显。结果见表3。

表3 光叶娃儿藤对小鼠甲醛致痛实验的影响 (x±SD，n=12)

4.2 抗炎作用

4.2.1 对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响

和对照组比较，光叶娃儿藤高和低剂量组对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀均有显著抑制作用 (P＜0.01)。结果见表4。

表4 光叶娃儿藤对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响 (x±SD，n=12)

4.2.2 对甲醛致小鼠足肿胀及足组织中PGE2含量的影响

和对照组比较，光叶娃儿藤高和低剂量组对甲醛致小鼠足肿胀及足组织中PGE2含量均有显著抑制作用 (P＜0.05);对PGE2含量影响呈量效关系，高剂量组和低剂量组比较有显著性差异 (P＜0.05)。结果见表5。

表5 光叶娃儿藤对甲醛致小鼠足肿胀及足组织中PGE2含量的影响 (x±SD，n=12)

5 讨论

研究镇痛药物常用的实验方法有热板法、扭体法与甲醛法。热板法主要用于中枢性镇痛药的筛选，扭体法主要反映外周性镇痛，小鼠足键膜皮下注射甲醛的甲醛法可引起两个时相的疼痛［7］，0～10min出现者为Ⅰ相 (早期相)，10～60min出现的反应为Ⅱ相 (迟发相)。第1相主要是直接刺激C纤维所致，如受试药物对此相有抑制作用则表明其作用为中枢性镇痛;第2相反应主要是炎症介质释放参与的疼痛反应，如药物对此相有抑制作用则表明其作用为外周镇痛。实验结果表明，光叶娃儿藤不能延长小鼠热板痛阈值，但能减少小鼠扭体次数，对甲醛引起疼痛的第二时相有显著镇痛作用，说明光叶娃儿藤能抑制继发的炎性反应所导致的炎性疼痛。用二甲苯所致小鼠耳廓肿胀法及甲醛致小鼠足跖肿胀法观察其抗炎作用，结果显示，光叶娃儿藤高和低剂量组对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀和甲醛致小鼠足肿胀及足组织中PGE2含量均有显著抑制作用，说明其对急性非特异性炎症有明显的抑制作用。综上所述，光叶娃儿藤水提取物可能是通过抑制炎症介质释放达到镇痛抗炎作用。

［1］国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草 (6)［M］.上海:上海科学技术出版社，1999:5733.

［2］陈奇.中药药理研究方法学［M］.第2版.北京:人民卫生出版社，2006:353－354.

［3］李仪奎.中药药理实验方法［M］.上海:上海科学技术出版社，2006:769.

［4］徐元翠.贯叶连翘提取物抗炎镇痛作用研究［J］.中国药师，2010，13(10):1435－1436.

［5］李仪奎.中药药理实验方法学［M］.北京:人民卫生出版社，2006:753－765.

［6］沙爱龙，陈红玲，孟庆艳.维药芳香新塔花水提取物的抗炎镇痛作用及其急性毒性［J］.中国实验方剂学，2012，18(4):202－204.

［7］姚东，孟宪生，潘英，等.气滞胃痛颗粒镇痛作用研究及机制初探［J］.中成药，2012，34(3):556－558.