耐甲氧西林金黄色葡萄球菌在肺炎致病机制中的研究进展
2012-04-18王芊,华川
王 芊,华 川
自1961年Jevone首次报道耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant staphylococcus aureus,MRSA)以来,其感染几乎遍布全球,已成为医院感染的重要病原菌之一[1]。MRSA可引起多种感染,如败血症、心内膜炎、肺炎、局部组织化脓性感染等。正是由于MRSA引起医院内感染的多重耐药性,其感染已被列为最难解决的三大感染性疾病之一[2]。MRSA引起的肺部感染的比例呈上升趋势。现就MRSA在肺炎致病机制中的研究进展综述如下。
1 概述
MRSA在体外药敏实验时,对甲氧西林耐药,但因为甲氧西林化学性质不稳定,通常以苯唑西林代替进行实验。按照美国临床实验室标准化委员会(national committee for clinical laboratory standards,NCCLS)的建议,凡检出mecA基因或青霉素结合蛋白2a(penicillin-binding trotein 2a,PBP2a)的葡萄球菌即可诊断为MRSA[3]。故直接检测金黄色葡萄球菌中的耐药基因mecA的反转录聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)方法被公认为检测MRSA 的“金标准”[4]。
2 MRSA耐药机制
MRSA除对甲氧西林耐药外,对其他所有与甲氧西林有相同结构的β-内酰胺类和β-内酰胺类/β-内酰胺酶抑制剂复合抗菌药物均耐药,还可通过产生修饰酶、改变抗菌药物作用靶位、降低膜通透性等机制,对氨基苷类、大环内酯类-林可酰胺-链阳菌素B及其衍生物奎奴普汀类、喹诺酮类等抗菌药物产生不同程度耐药。MRSA多药耐药特性与菌株携带的耐药基因密切相关。
2.1 葡萄球菌盒式染色体(staphylococcal cassette chromosome mec,SCCmec)MRSA 对 β-内酰胺类抗生素耐药原因在于MRSA携带mecA基因。mecA基因编码一种新型PBP2a。在对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌中,只存在内源性PBP,它是细菌细胞壁合成时所必需的转肽酶,这种酶容易与β-内酰胺类药物结合而失去活性,导致细菌细胞壁合成障碍,进而杀死细菌[5]。然而在MRSA中,PBP被PBP2a取代,PBP2a对青霉素类抗生素的亲和力低,结合力弱,因此青霉素类抗生素无法结合并作用于PBP2a,使其活性不被抑制。因此,MRSA可以通过PBP2a持续合成细胞壁,从而得以生长,表现为对β-内酰胺类抗生素(青霉素、半合成青霉素、第2代头孢菌素)耐药[6]。而mecA基因就存在于携带mec基因的SCCmec这样一个可移动基因元件中。
SCCmec由 mec、ccr复合体和 J 区域构成[7]。mecA为结构编码基因,可编码产生PBP2a;ccr复合体将 SCCmec从特定位点——SCCmec attachment site(attBscc)删除或整合进金黄色葡萄球菌染色体中。而末端正序重复序列(direct repeat sequence,DR)、反序重复序列(inverted repeat sequence,IR)和J区域,有助于SCCmec在细菌细胞间的传递[8]。每个SCCmec元件具有3个J区。1个SCCmec元件组成结构包括J3-mec-J2-ccr-J1。J区包含多种对细菌细胞不重要、无用的基因和假基因及一些从质粒或转座子获得的对非β-内酰胺类抗生素和重金属耐药的基因。现在认为它们是细菌在进化过程中为适应环境、从外界获得的对生存有益的基因。此外,J区域是区分SCCmec亚型的依据之一[9]。
Berger和 Rohrer[10]及周义正等[11]研究均表明,mecA基因表达水平与葡萄球菌属对甲氧西林的耐药水平并无明显相关性,即影响葡萄球菌属对甲氧西林耐药水平的相关基因是位于SCCmec外的一群以fem基因为代表的管家基因,femA是MRSA表达对β-内酰胺类抗生素高水平耐药所必需的,这些基因能直接或间接在肽聚糖的生物合成中发挥作用,并具有其他调控功能,但对PBP2a表达并无影响。
2.2 主动外排系统 有研究显示,MRSA中存在多种主动外排系统,可显著降低细胞内抗菌药物的浓度,同时由于主动外排系统转运底物的广泛性,使细菌呈现多种化学结构完全不同的抗菌药物高度耐药。主动外排是金黄色葡萄球菌耐喹诺酮类抗菌药物的重要机制之一[12]。金黄色葡萄球菌还存在qae、smr等多种外排系统,qae外排泵研究较多。qac基因是位于金黄色葡萄球菌不同质粒上消毒剂抗性决定因子,根据其抗性情况及DNA同源性可分为两大家族,即:qacA/qacB及qacC/qacD家族,都编码对染料及季铵盐类的抗性。qacA/B基因表达外排泵蛋白,获得qacA/B基因可表现对胺类(如苯扎溴铵)、胍类(如双氯苯舣胍已烷)和腙类消毒剂耐药[13]。qac家族除对消毒剂耐药外,对多种抗菌药物存在高耐药率。近年来,有学者证明MRSA携带的qac外排泵还能外排左氧氟沙星和利福平[14],提示qae外排泵对MRSA多重耐药性的产生也有一定作用。
2.3 van基因 随着MRSA对万古霉素等糖肽类抗菌药物的敏感性不断降低[15],耐万古霉素金黄色葡萄球菌的出现,MRSA对糖肽类抗生素(以万古霉素、替考拉宁为代表)耐药机制研究也日益受到重视。有研究显示,通过质粒从肠球菌转移来的van基因,能改变糖肽类药物靶位,是耐万古霉素金黄色葡萄球菌对糖肽类抗生素耐药性的主要机制[16]。
3 MRSA致病机制
金黄色葡萄球菌可以分泌20多种毒性蛋白质,如溶血毒素、杀白细胞毒素(panton-valentine leukocid,PVL)、肠毒素、中毒性休克综合征毒素-1(toxic shock syndrome toxin,TSST-1)等都是重要的致病物质,可引起不同严重程度的临床表现。近年来,PVL及TSST在金黄色葡萄球菌感染的肺炎研究中日益受到重视。
PVL是金黄色葡萄球菌产生的外毒素,通过噬菌体携带后与金黄色葡萄球菌的染色体结合,是重要的致病因子,其通过2种分泌型蛋白(Luks-PV和Lukf-PV)的协同作用(这2种成分各自均无细胞毒性,结合后才产生细胞毒性),攻击中性粒细胞、巨噬细胞等,作用于白细胞的细胞膜,导致细胞通透性增加,钾离子丢失,最终使细胞死亡[17],可在儿童和成人患者中引起坏死性肺炎等。携带PVL基因的MRSA在美国、欧洲、亚洲和非洲等国家有引起严重感染的报道,甚至在有些国家造成克隆株的播散,主要引起化脓性感染和严重的肺部感染[18-19]。据研究显示金黄色葡萄球菌肺炎病死率为10%,而携带PVL基因病死率高达75%[20]。此外,虽然多项研究已表明PVL与社区获得性肺炎感染密切相关[21-23],但有关PVL许多问题仍未解决,包括其在侵入性疾病期间大量表达以及人体免疫对其的作用[24]。
TSST-1是金黄色葡萄球菌产生的一种外毒素,可引起机体发热及休克,并增加对内毒素的敏感性,属于致热源性超抗原家族,其在介导感染性休克和脏器损害中具有重要意义。李宏等[25]研究显示,同时携带PVL和TSST-1基因的MRSA可导致更严重的感染性疾病,呈现严重的多重耐药性,增加了临床抗感染治疗的难度,甚至危及患者生命。
4 MRSA分型研究在肺炎致病机制中的应用
4.1 SCCmec分型 根据mec和ccr复合体的不同组合以及SCCmec原件上的不同特异性位点对SCCmec进行分型。研究表明,SCCmec分型是区分医院感染和社区获得性感染的一个重要指标,医院获得性肺炎感染的MRSA菌株,常携带的是Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ型SCCmec中的一种,而社区获得性肺炎感染MRSA或非MRSA菌株携带的是Ⅳ或Ⅷ型SCCmec。此外,还可以探讨菌株间的遗传进化联系和耐药基因携带状况,是分子流行病学和耐药机制研究的一种重要手段。对地区性MRSA进行SCCmec分型,不但可以探明其流行株的SCCmec型别、分布、耐药基因携带现状,为预测其耐药性发展趋势、有效治疗其感染、预防其暴发流行提供对策和依据,而且可为新药开发寻找突破口、为耐药机制研究奠定基础,并能与其他国家或地区的MRSA进行对比研究[26]。
4.2 多位点测序(MLST分型)及随机引物PCR(AP-PCR)分型 金黄色葡萄球菌7个管家基因,即氨基甲酸激酶基因(carbamatek inase,arcC)、莽草酸脱氢酶基因(shik imatedehydrogenase,aroE)、甘油激酶基因(glycerol kinase,glp)、鸟嘌呤核苷酸激酶基因(guanylate kinase,gmk)、磷酸转乙酰酶基因(phosphate acetyltransferase,pta)、磷酸丙糖异构酶基因(triosephosphate isomerase,tpi)和乙酰辅酶A乙酰转移酶基因(acetyle coenzyme A acetyltransferase,yqi)。选择7个管家基因450~500 bp的片段进行分析,每个基因片段不同的序列被认定为不同的等位基因点,每个管家基因就有多个等位基因点,每株细菌都可通过7个管家基因的不同等位基因点进行序列分型[27]。由于7个管家基因都有不同的等位基因点且基因序列发生变异的速度非常缓慢,只有来自同一克隆株的菌株间才有可能具有同一基因序列型。张雪青等[28]通过这一分型来研究MRSA在肺部感染流行株的起源、不同菌株间的关系,以探明本地流行株与世界流行株之间的关系,取得了一定的进展。
AP-PCR是在相当低的退火温度下,采用单一引物非特异性地识别细菌染色体上的相应位点,使之发生多位点结合,经PCR扩增后电泳,产生复杂基因组的指纹图谱,根据指纹图谱的多样性可进行分型。AP-PCR分型已成为MRSA分型研究的一个重要方向。
5 结语
MRSA所致肺部感染大多发生在免疫力低下、伴严重基础疾病以及新生儿,术后及大面积烧伤、长期在重症监护室、高龄、意识障碍、侵入性操作是MRSA感染的危险因素。此外,MRSA有向社区扩散的趋势,在社区获得性感染中MRSA所占比例逐年上升,成为严重的公共卫生问题。因此,有效预防和控制多重耐药菌感染已成为重大公共卫生问题。依据药敏监测结果,优化选择抗菌药物,合理选择抗生素等对MRSA防治尤为重要;对MRSA分布调查及耐药性研究都是今后重要的研究方向。
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