高效液相色谱法拆分盐酸舍曲林片的光学异构体

陈积暖，冯晓梅

(海南天煌制药有限公司，海南 海口 570203)

盐酸舍曲林为选择性抑制5－羟色胺再摄取的抗抑郁药(SSRI)，目前已成为抗抑郁治疗的一线药和首选药。盐酸舍曲林存在4种光学异构体，在合成工艺过程中可能会引入中间杂质(顺式左旋异构体，反式左旋异构体，反式右旋异构体)。目前其异构体检测方法为毛细管电泳法(只对顺式左旋异构体进行检测)，其他杂质检测采用反相高效液相色谱法，但主峰与其相邻异构体峰不能很好分离。笔者参考相关文献，经方法学研究，建立了盐酸舍曲林有关物质的检测方法[1－2]，现报道如下。

1 仪器与试药

LC－10AVP/SPD－10Avp高效液相色谱仪(日本岛津);浙大2010色谱工作站。Hypersil ODS2色谱柱(大连伊利特，150 mm×4．6 mm，5 μm)。乙腈为色谱纯，磷酸二氢钠、β － 环糊精、HP －β－环糊精，三乙胺均为分析纯;盐酸舍曲林片(自制，批号为090301，090302，090303，规格为每片 50 mg;批号为 0812302，浙江新东港药业股份有限公司，规格为每片50 mg);盐酸舍曲林对照品(批号为20070403M，含量99．6%)，盐酸舍曲林(1R4S)异构体对照品(批号为20060401，含量99．2%)，盐酸舍曲林(1S4R)异构体对照品(批号为 20060401，含量 98．6%)，盐酸舍曲林(1R4R)异构体对照品(批号为 20060401，含量 99．8%)，均由浙江新东港药业股份有限公司提供。

2 方法与结果

2．1 色谱条件与测定方法

色谱条件:照高效液相色谱法[2005年版《中国药典(二部)》附录VD]测定。用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以磷酸二氢钠缓冲液[取磷酸二氢钠 12．5 g，β － 环糊精 12．8 g，HP－ β － 环糊精 17．3 g，加水至 1 000 mL]－ 乙腈 － 三乙胺(800 ∶200 ∶10)，用磷酸调节pH至(2．5±0．5)为流动相;检测波长为214 nm;流速为1．0 mL/min。盐酸舍曲林峰与异构体峰的分离度不得小于1．5，理论板数按盐酸舍曲林峰计算应不低于2 000。

测定方法:取本品10片，研细，精密称取适量，用流动相溶解并制成每1 mL中含盐酸舍曲林1 mg的溶液，摇匀，滤过，作为供试品溶液;另取盐酸舍曲林顺式左旋构体、反式左旋异构体、反式右旋异构体对照品适量，加流动相溶解并制成每1 mL中含盐酸舍曲林顺式左旋构体10 μg和反式左旋异构体、反式右旋异构体各5 μg的溶液，作为对照品溶液。取对照品溶液20 μL，注入液相色谱仪，调节检测器灵敏度，使主成分峰高约为满量程的20%;再精密量取供试品溶液与对照溶液各20 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主峰保留时间的2倍。供试品溶液色谱图中如有杂质峰，盐酸舍曲林异构体按外标法以峰面积计算，供试品中含顺式左旋构体的量不得过1．0%，含反式左旋异构体、反式右旋异构体的量均不得过0．5%。

2．2 溶液配制

取本品10片，研细，称取约0．35g(相当于盐酸舍曲林10 mg)，精密称定，置100 mL的量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，作为供试品溶液。取盐酸舍曲林顺式左旋构体、反式左旋异构体、反式右旋异构体对照品适量，加流动相溶解并稀释制成每1 mL中含盐酸舍曲林顺式左旋构体10 μg和反式左旋异构体、反式右旋异构体各5 μg的对照品溶液。按处方比例称取本品辅料混粉适量，照供试品溶液配制方法配制空白辅料溶液。

2．3 方法学考察

系统适用性试验:吸取2．2项下对照品溶液，作为系统适用性试验溶液，在拟订的色谱条件下，吸取20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图。结果盐酸舍曲林峰的理论板数为4 562．6，与盐酸舍曲林光学异构体峰的分离度为3．56。见图1 A。结果表明，该色谱条件系统适用性试验好，能满足中国药典规定的试验要求。

干扰试验:取2．2项下空白辅料溶液，在拟订的色谱条件下，取20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图。结果保留时间为2．0 min的位置有一小峰出现，但在主峰及其他3个光学异构体峰处未见有吸收峰(见图1 B)，故辅料对测定不存在干扰。取空白溶剂20 μL，依法注入液相色谱仪，结果试验所用的溶剂没有吸收峰(见图1 C)，故对盐酸舍曲林及其光学异构体的测定没有干扰。

图1 系统适用性与干扰试验图谱

专属性试验:取供试品(090301批)细粉约0．35 g，共4份，分别进行以下试验。加入6 mol/L盐酸溶液5 mL，室温放置15 h后，用6 mol/L氢氧化钠溶液中和(强酸破坏);加入6 mol/L氢氧化钠溶液5 mL，室温放置10 h后，用6 mol/L盐酸溶液中和(强碱破坏);加少量流动相溶解后，置100℃水浴中加热8 h，放冷(热破坏);取供试品细粉约0．35 g，加入5%H2O2溶液5 mL，室温放置15 h(氧化破坏)。将以上溶液分别加流动相稀释至100 mL，摇匀，滤过，各取20 μL进样测定，记录色谱图。结果各溶液色谱中盐酸舍曲林峰与各杂质峰分离度分别为 2．553，2．663，2．856，2．993，见图2。可见，建立的色谱条件能分离破坏主要产物。

图2 破坏性试验图谱

进样精密度试验:分别精密称取盐酸舍曲林4个光学异构体对照品，加流动相溶解并稀释制成每1 mL中含盐酸舍曲林、顺式左旋构体各10 μg，反式左旋异构体、反式右旋异构体各5 μg的混合对照品溶液，各取20 μL注入液相色谱仪，连续进样6针，记录色谱图。结果盐酸舍曲林有关物质1R4S，1S4R，1S4S，1R4R峰面积的平均值分别为 445 595．1，444 615．7，875 248．0，928 359．5，RSD分别为 1．6%，1．1%，0．4% ，1．4%(n=6)，表明仪器进样精密度良好。

有关物质定位试验:分别精密吸取盐酸舍曲林4个光学异构体对照品溶液20 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果盐酸舍曲林4个光学异构体1R4S，1S4R，1S4S，1R4R的保留时间分别为22．929，26．261，31．960，36．052 min。

线性关系考察:分别精密称取盐酸舍曲林4个光学异构体对照品，加流动相溶解并稀释制成每1 mL中含盐酸舍曲林、顺式左旋构体各100 μg，反式左旋异构体、反式右旋异构体各50 μg的混合贮备溶液，分别精密量取溶液 0．1，0．4，0．6，0．8，1．0，1．2，1．4 mL，置 10 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，取 20 μL分别注入液相色谱仪，记录色谱图。以进样量(μg)为横坐标、峰面积为纵坐标求得回归方程。结果见表1。

表1 盐酸舍曲林有关物质线性回归方程及 r值

定量限确定:取盐酸舍曲林4个光学异构体对照品适量，用流动相配制成一定质量浓度，逐级递减稀释，分别精密吸取20 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。经测定，按信噪比约10∶1计，1R4S，1S4R，1S4S，1R4R 定量限为 6，4．8，4．4，6 ng，且其结果具一定精密度。见表2。

表2 盐酸舍曲林4个光学异构体定量限(精密度试验)结果

2．4 样品检测结果

取本品，照拟订的方法测定，采用外标法测定盐酸舍曲林的3个光学异构体。结果见表3。可见，3批自制样品及上市样品有关物质检测结果均符合规定。

表3 样品光学异构体测定结果(外标法)

3 讨论

参照盐酸舍曲林质量标准[3]有关物质项下的色谱条件，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以磷酸缓冲液(取磷酸10 mL，三乙胺3 mL，加水至1 000 mL)－甲醇－乙腈(40∶60∶10)为流动相，检测波长220 nm，结果盐酸舍曲林4个光学异构体色谱峰彼此相互重叠，得不到分离;参照文献[4]，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以磷酸钠缓冲液(含0．17 mol/L磷酸钠、10．5 mmol/L HP－β－环糊精)－乙腈(68∶32)为流动相，检测波长225 nm，结果盐酸舍曲林1R4S与1S4R两个异构体完全重叠，与其他异构体色谱峰能得到很好的分离。通过试验摸索可知，流动相体系含有HP－β－环糊精时可使盐酸舍曲林光学异构体1S4S和1R4R与1R4S和1S4R得到分离，故参照文献[5]，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以磷酸二氢钠缓冲液(含0．02 mol/L磷酸二氢钠、10 mmol/L HP－β－环糊精、10 mmol/L β－环糊精)－乙腈(80 ∶20)为流动相，检测波长 214 nm，流速 1．5 mL/min。此时盐酸舍曲林4个光学异构体色谱峰之间能得到很好的分离，但供试品溶液主峰峰形宽大，且各峰保留时间较长，流速较大，会造成柱压过高。因此对色谱条件进行了优化，磷酸二氢钠浓度改为80 mmol/L，增加了HP－β－环糊精及β－环糊精的溶解度，稳定了药物所形成的包合物，加入了三乙胺(含量1%)减轻和消除峰拖尾现象，同时稍增加了HP－β－环糊精(11 mmol/L)及β－环糊精(11 mmol/L)的浓度，使保留时间得到提前。因HP－β－环糊精及β－环糊精对顺式及反式异构体识别能力的强弱不一致，兼顾分离度和色谱峰形，选择流速为1．0 mL/min。

方法学考察结果显示，所选方法适合于本品光学异构体的检测要求。由于盐酸舍曲林存在4种光学异构体，目前其异构体检测方法为毛细管电泳法和手性柱进行折分[6]，价格昂贵，且手性柱不容维护、通用性差;采用常规的反相色谱法，4个光学异构体彼此重叠而不能分离，没法控制本品的质量。采用反相色谱法，在流动相系统中加入HP－β－环糊精及β－环糊精，可以在同一色谱条件中拆分4种光学异构体[7]，使其操作简便、快速、分离效果好，比较经济，较手性固定相法和毛细管电泳法普及。但由于其流动相系统酸性较强，HP－β－环糊精及β－环糊精容易造成柱子堵塞，使柱压升高，色谱柱容易损伤，因此试验后需花较长时间清洗色谱柱。建议在选择色谱柱时，选择一些耐酸性较强的色谱柱。

[1]苏立强，李 冲，张晓红，等．高效液相色谱流动相添加剂法拆分头孢氨苄对映体[J]．药物分析杂志，2008，28(6):921－923．

[2]国家药典委员会．中华人民共和国药典(二部)[M]．北京:化学工业出版社，2005:附录XIX A．

[3]YBH24572005，国家药品标准·盐酸舍曲林[S]．

[4]陈德英，陈玉英，胡育筑．HP－β－环糊精对盐酸舍曲林异构体手性选择包合和色谱保留行为影响的研究[J]．色谱，2004，22(6):595－600．

[5]孙 山，黄 信．HPLC法测定盐酸舍曲林有关物质研究[J]．四川医学，2005，26(7):761 －762．

[6]WS1－(X－452)－2003Z，国家药品标准·新药转正标准(第47册)盐酸舍曲林片．

[7]宁凤容，黄可龙，焦飞鹏．HP－β－CD手性流动相HPLC法拆分萘普生对映体的色谱保留机制和拆分机理研究[J]．化学通报，2006，69(6):425．