自身骨髓间充质干细胞及其分化的神经干/前体细胞移植治疗神经系统疾病临床观察

任 超，刘小云，万美荣，耿德勤，葛 巍，李金梅，张伟伟

(1徐州医学院研究生学院，江苏徐州221002;2徐州医学院附属医院)

神经细胞一旦损伤坏死、退行性变，无法自行修复［1］。目前的对症支持、神经保护等治疗疗效有限。近年来用干细胞治疗神经系统疾病的概念被提出［2］，尤其是骨髓间充质干细胞，其相关的动物实验研究成果喜人，在临床研究方面也取得了一些进展，前景诱人，但其临床疗效及安全性尚未确定。我们在神经干细胞的基础研究方面取得了一些成果［3，4］，利用脑脊液诱导人间充质干细胞定向分化为神经前体细胞已经申请专利(专利号: ZL0810020094.3)，并于2009年11月开展了临床应用，目前已治疗神经系统疾病30例，其中随访满2 a且资料齐全者有7例。现分析此7例的随访观察结果。

1 资料与方法

本组7例自接受干细胞移植治疗至今随访已满2 a，其中男6例，女1例;年龄例1为12岁、例2为59岁、例3为41岁、例4为16岁、例5为18岁、例6为46岁、例7为12岁。病毒性脑炎致植物状态1例，缺血缺氧性脑病致醒状昏迷1例，遗传性共济失调1例，颅脑损伤后脑瘫2例，急性脊髓炎1例，多发性硬化1例。纳入标准:①经脑保护治疗，患者生命体征平稳。②入选者均经医院伦理委员会批准，且经患方签署特殊治疗同意书。③使用自体骨髓源干细胞治疗。④随访满2 a。排除标准:非自体骨髓源干细胞治疗、随访未满2 a及资料不全者。细胞移植治疗前于患者髂后上棘穿刺抽取自体骨髓，Percoll法分离单个核细胞，进行培养，细胞经胰酶消化贴壁后，反复扩增传代，并标记为P1～P5代。胰酶消化P5代对数生长期的骨髓间充质干细胞，DMEM/F12无血清培养基培养24 h，用患者脑脊液覆盖细胞，72 h后每天加入脑脊液10 μL，共3 d，制备5 mL神经干细胞悬液。对诱导前的P1代细胞及诱导后6、48、72、96 h的细胞从形态学、免疫组织化学、荧光免疫组织化学等方面进行鉴定。以患者L3～4椎间隙为穿刺点，采用腰椎穿刺术鞘内注射法将鉴定的干细胞注入蛛网膜下腔。例1、2、3、6、7各注射4次，例4注射3次，例5注射1次。术后对患者进行1周的生命体征监测，详细记录各种不适。术后随访:对1例遗传性共济失调患者，通过世界神经病联合会国际合作共济失调量表(ICARS)［5］进行疗效判定;对1例急性脊髓炎患者，通过国际神经修复学会脊髓损伤功能评价量表(IANR-SCIFRS)［6］进行疗效判定;对1例多发性硬化患者，通过剑桥多发硬化基本量表(CMSBS)［7］进行疗效判定;对2例昏迷患者，通过Glasgow昏迷量表(GCS)［8］进行疗效判定;对2例脑瘫患者，通过脑性瘫痪调查问卷表(CPSQ)［9］进行疗效判定。

2 结果

例1:干细胞移植治疗前，患者处于持续昏迷状态1个月余，双侧瞳孔不等大(左侧直径约3 mm，右侧约5 mm)，对光反射消失，双侧视乳头水肿，双侧Babinski征阳性，肌张力下降，腱反射(－)，对疼痛刺激不敏感，GCS 4分。干细胞移植治疗后1个月，患者虽仍处于昏迷状态，但对疼痛刺激敏感程度有改善，双侧瞳孔虽不等大，但右侧瞳孔直径约恢复至4 mm，视乳头水肿减轻，GCS 6分。3个月时查体及GCS与1个月时无明显变化，但脑电图及脑干听觉诱发电位表现有所改善(移植前脑电基本节律消失，听觉诱发电位波形难以分辨;移植后脑电图可见少许δ波，听觉诱发电位可见Ⅰ波)，头颅影像学表现有好转。6个月时患者仍处于昏迷状态，但对于疼痛刺激敏感程度有明显改善，双侧瞳孔等大等圆，直径约3 mm，视乳头水肿基本消失，GCS 8分。随访满1 a时患者生命体征平稳，GCS 9分。随访满2 a时患者因继发严重肺部感染而死亡。

例2:干细胞移植治疗前，患者处于持续昏迷状态，双侧瞳孔等大等圆，对光反射灵敏，四肢肌张力增高，腱反射(+)，双侧Babinski征(－)，疼痛刺激有屈曲逃避反应，对声音刺激不敏感，GCS 6分。干细胞移植治疗后1个月患者仍处于昏迷状态，四肢肌张力正常，对疼痛刺激有局限反应，声音刺激敏感性较前改善，GCS 9分，脑电图及脑干听觉诱发电位较治疗前有改善(移植前脑电图平为坦波形，听觉诱发电位波形难以分辨;移植后脑电图平坦波间见少许δ波，听觉诱发电位可见Ⅰ波)。3个月时GCS无明显变化，6个月时提高至10分，满1 a时11分，满2 a时随访患者因继发严重肺部感染而死亡。

例3:干细胞移植治疗前，患者言语不清，构音障碍，站立不稳，行走困难，平衡能力差，有运动性及意向性震颤，四肢肌肉轻度萎缩、肌力正常、肌张力增高，腱反射消失，病理征未引出，ICARS评分59分。干细胞移植治疗后1个月，患者言语不清、构音障碍症状有明显改善，其余症状改善不明显，ICARS评分56分。3个月时肌张力增高症状有所好转。6个月时运动性及意向性震颤、平衡能力等有所改善，ICARS评分51分。随访满1 a时患者运动性及意向性震颤、平衡能力等继续好转，ICARS评分44分。随访满2 a时患者症状、体征及ICARS评分与1 a时相比无明显变化。

例4:干细胞移植治疗前，患者四肢肌张力增高，左侧偏身痛温觉减退，左侧肢体肌力2级、右上肢3级、右下肢2级，双侧Babinski征(+)，左侧膝阵挛、踝阵挛阳性，CPSQ评分252分。干细胞移植后1个月，左下肢肌力3级，右下肢肌力3级，肌张力下降不明显，CPSQ评分242分。3个月时肌张力较前有所下降，CPSQ评分无明显变化。6个月时左上肢肌力3级，CPSQ评分232分。随访满1 a时查体及CPSQ评分较6个月时无明显变化。随访满2 a时患者右上肢肌力达4级，CPSQ评分225分。

例5:干细胞移植治疗前，患者双上肢肌力4级、双下肢2级，肌张力正常，腱反射(－)，右侧Babinski征(+)，T6平面以下痛觉减退，IANR-SCIFRS评分15分。干细胞移植后1个月，患者四肢肌力无明显变化，IANR-SCIFRS评分17分。3个月时痛觉减退平面下降至T8平面以下，IANR-SCIFRS评分19分。6个月时查体及IANR-SCIFRS评分较3个月时无明显变化。随访满1 a时患者双下肢肌力恢复至3级，IANR-SCIFRS评分20分。随访满2 a时患者痛觉减退平面下降至T11平面以下，双上肢肌力恢复至5级，双下肢肌力恢复至4级，大小便自控功能增强，IANR-SCIFRS评分24分。

例6:干细胞移植治疗前，患者言语欠利，走路不稳，双上肢肌力4级、双下肢3级，肌张力增高，腱反射亢进，下颌反射(+++)，掌颌反射(+)，双侧Babinski征(+)，双侧Chaddock征(+)，CMSBS评分14分。干细胞移植后1个月，患者肌张力略有下降，CMSBS评分12分。3月时查体及CMSBS评分较1个月时无明显变化。6个月时，双下肢肌力达4级，CMSBS评分11分。随访满1 a时双上肢肌力达5级，CMSBS评分9分。随访满2 a时查体及CMSBS评分较1 a时无明显变化。

例7:干细胞移植治疗前，患者双下肢肌力0级，左侧上肢肌力4级，腱反射(++)，双下肢Babinski征(+)，CPSQ评分233分。干细胞移植后1个月，查体及CPSQ评分较治疗前无明显变化。3个月时双下肢肌力1级，腱反射(+)，CPSQ评分225分。6个月时左上肢肌力达5级，CPSQ评分217分。随访满1 a时双下肢肌力达2级，CPSQ评分209分。随访满2 a时查体时左侧巴氏征可疑，但CPSQ评分无明显变化。

7例患者细胞移植术后有的出现低热，但无需特殊处理。随访中未见肿瘤形成等干细胞移植后可能出现的严重并发症。

3 讨论

骨髓间充质干细胞及其诱导分化的神经干/前体细胞的突出优点是具有自行分化和自我更新的能力，可以分化成神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞，产生更多的细胞因子如粒细胞集落刺激因子、基质细胞衍生因1、脑衍化神经营养因子、神经胶质细胞衍化营养因子等［10］。目前认为其主要通过如下机制修复神经损伤:①替代作用:Fleischman等［11］报道骨髓间充质干细胞可以向血管内皮祖细胞分化;Takahashi等［12］认为其还可向神经细胞方向分化，有利于损伤神经、血管组织的修复。Fukunaga等［13］发现，在骨髓间充质干细胞移植区内有复杂的血管形成，出现神经微丝阳性细胞，酪氨酸羟化酶(TH)染色发现带有长树突的神经元样细胞，提示骨髓间充质干细胞能在成年人脑中成活，分化为成熟的中枢神经系统组织细胞，并在移植区内及其周围形成血管。②诱导神经干细胞分化为神经元，并增加分化后神经元的存活率。③营养作用:通过分泌神经营养因子(NT)、白细胞介素类、干细胞因子等［14］，对神经功能的恢复具有促进作用。骨髓间充质干细胞还可产生对谱系发展十分重要的自分泌和旁分泌因子。另外，神经系统损伤后，各种神经因子如脑源性神经生长因子(BDNF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)、胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)、神经生长因子(NGF)、转化生长因子β1 (TGF-β1)等在脑细胞中被诱导产生，有助于移植的骨髓间充质干细胞的存活、增殖和向病损部位迁移［15］。④桥接作用:为宿主轴突再生提供一个连接通道，让再生的神经轴突能够顺利通过损伤处，为损伤脊髓的远、近侧残端重新形成神经突触联系创造条件。⑤迁移能力:骨髓间充质干细胞具有向病变组织定向迁移和发生位点特异性分化的能力，有利于移植的骨髓间充质干细胞向受损伤部位迁移。Chen等［16］将Brdu标记的骨髓间充质干细胞移植入大脑中动脉闭塞(MCAO)模型的雄性小鼠体内，14 d后神经损伤评分明显下降，免疫组织化学染色结果显示Brdu阳性细胞可在损伤大脑半球的多个部位出现，如皮质、纹状体等。

临床上已有用骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤［17］、用自体骨髓间充质干细胞鞘内注射治疗多发性硬化［18］的报道。本组7例神经系统病变患者采用自体骨髓间充质干细胞及其诱导分化的神经干/前体细胞鞘内注射治疗，也取得了明显疗效，未见肿瘤形成等干细胞移植可能并发症。说明该方法治疗中枢神经系统疾病安全、有一定疗效。但观察病例数少，疾病的针对性也比较有限。要得到确切结论，尚需大宗病例的应用和观察。

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