早期糖尿病肾病的生物标志物

李贵森 综述 王 莉 审校

近年来，糖尿病发病率逐年增加，已经成为全世界严重的公共健康问题。根据美国疾病控制中心(CDC)的最新数据显示，近五十年来美国糖尿病患者数量持续快速增加，截止2009年已达2 100万。2008年完成的全国糖尿病流行病学调查资料表明，我国年龄校正后的糖尿病患病率高达9.7%，在不到30年的时间内增长了15倍，由此估计的我国糖尿病患者数高达9 240万［1］。对大宗无白蛋白尿且血清肌酐(SCr)正常的2型糖尿病(T2DM)患者超过15年的随访发现，38%患者出现白蛋白尿，28%患者肌酐清除率下降(＜60 ml/min)［2］。通常30%的1型糖尿病(T1DM)和40%的T2DM最终会发展为糖尿病肾病(DN)。DN已经成为慢性肾功能衰竭的主要原因之一。糖尿病患者是否会发生DN，将会发生哪种类型肾脏相关的临床事件，以及DN如何发生发展，如何对肾病进行恰当的临床分期和疗效判断，都需要合适的生物标志物。现有的生物标志物已不能满足临床的需要，寻找新的DN生物标志物，是目前DN的研究热点之一。由于近年各种“组学”的兴起，包括基因组学，转录组学，蛋白质组学及代谢组学等，为寻找DN生物标志物提供新的思路和平台，使DN相关生物标志物的研究出现飞速发展。本文将对早期诊断DN的生物标志物做一简述。

理想的早期DN生物标志物

生物标志物是用来表达某种生物学状态或过程的物质，能够反映机体内存在某种微生物或生物学过程，特殊疾病状态，或者具有特殊DNA序列片段或特殊遗传信息。生物标志物可以是蛋白质，肽段，核酸，糖化合物，脂类化合物及小分子物质等。临床上，生物标志物常常用于疾病筛查和诊断(包括临床疗效判断)。用于疾病筛查的理想生物标志物必须具有高度特异性，假阳性和假阴性率低，能反映疾病早期状态，易于检测，能从血清或尿液中检出为佳，同时要求性价比高。而用于疾病诊断的理想生物标志物必须对疾病状态有很好的敏感度、特异性和精确性，可以预测疾病预后、复发和疗效。

理想的早期DN的生物标志物也应具有上述特点，即能够高效地早期筛查或诊断DN，便于检测、稳定性好且性价比高。但同时还应能预测哪些糖尿病患者会发生DN，而哪些DN会进展至终末期肾病，以及DN进展速度和治疗反应。

白蛋白尿不是理想的早期DN生物标志物

目前临床广泛应用的DN生物标志物包括尿微量白蛋白和SCr。由于SCr不能反映早期肾脏损害，且不能区别肾脏病变性质，在早期诊断DN的临床应用中受到限制。目前常用尿白蛋白诊断和筛查DN，其利用随机尿标本，采用自动化分析仪进行检测，方便且性价比高，被广泛用于临床。对736份尿标本的研究表明，长期(中位时间 11.2年)在－70℃下存储，对尿白蛋白，尿白蛋白肌酐比(ACR)的重复性无明显影响［3］，提示该指标稳定性好。此外，尿白蛋白水平对于糖尿病患者心血管事件或者心力衰竭的发生风险均有很好的预测价值，同时治疗后尿白蛋白变化也与心血管事件的风险有相关趋势，表明它对重要临床不良事件及治疗都有良好的预测价值［4］。但是尿白蛋白并不能预测糖尿病患者是否会发生肾功能的变化，同时也不能预测肾脏病变的转归。例如，前述的对糖尿病长期随访的研究中，肾功能下降的1 132例患者中有575例(51%)患者并未出现白蛋白尿［2］。另外，相当一部分微量白蛋白尿的糖尿病患者其尿白蛋白可能转阴，目前还不能预测哪些患者可能转阴。由此可见，尿白蛋白还不是一个理想的DN生物标志物，我们还需要更多新的DN生物标志物。

核酸生物标志物

寻找DN的遗传易感性仍然是研究热点。仅部分糖尿病患者发生DN，同时DN发病常表现出家族聚集性及种族差异，提示DN的发生存在遗传易感性。全基因组连锁分析显示 3q，7q35－36，7p15，10q26，13q33.3，18q22－23 等区域与 DN 连锁［5－7］。结合进一步精细定位，测序及基因功能研究，发现了多个与 DN 易感性相关的候选基因［5，6］。

利用候选基因关联分析，或者全基因组关联分析，也发现多个基因变异可能影响个体对DN的易感性。对1 889例高加索人T1DM患者进行全基因组关联研究，并利用糖尿病控制及并发症治疗(DCCT)的样本中进行重复，结果发现，FRMD3和CARS基因的三个单核苷酸多态性(SNP)可增加患DN的风险［8］。另一项对于T2DM伴发肾脏病患者的全基因组关联研究，尽管未发现相关性，但RPS12，LIMK2，和SFI1基因可能作为T2DM患者发生DN的候选基因［9］。

Mooyaart等［10］对671篇DN关联分析的文章进行荟萃分析发现，有34个遗传变异进行了重复研究，通过随机效应模型分析显示，有21个变异仍然与DN强烈相关，这些变异分别位于或者邻近下述基因:ACE，AKR1B1，APOC1，APOE，EPO，NOS3，HSPG2，VEGFA，FRMD3，CARS，UNC13B，CPVL，CHN2和GREM1，另外四个变异未邻近特殊基因。这些基因相关的变异，例如 APOE(E2)，APOC1 rs4420638(G)，CARS rs739401(A)，ACE rs179975(D)等均显著增加糖尿病患者发生DN的风险，而APOE(E4)，FRMD3rs1888747(C)，VEGFA rs833061(C)等明显降低个体患DN的风险。

这些基因变异均可作为预测DN发生发展的生物标志物。但是由于DN属复杂性疾病，每个基因变异仅仅做出微小的贡献。即使我们对所有已经证实的变异进行联合检测，临床上也只能解释一小部分患者，此外，这些变异对DN易感性影响还存在明显的种族差异［11］。其预测价值和效力受到限制。因此进一步对DN患者DNA甲基化和microRNA等表观遗传学变异进行深入研究，有可能寻找出一些新的生物标志物，同时对研究DN发病机制将有很大的帮助。

蛋白质生物标志物

采用蛋白组学等技术寻找DN新的生物标志物是目前的研究热点。Ameur等［12］分析近年相关研究发现，这些研究采用不同的蛋白质组学方法和平台，研究尿液和血清结果发现了一些新的具有提示性的生物标志物，例如AABP，apoAI等多种蛋白质成分下调，而脂联素，白蛋白片段等多种蛋白质成分上调。遗憾的是，上述结果尚未进行广泛的临床验证，同时这些蛋白质上调或下调的生物学意义尚不清楚，因此它们的应用价值尚不清楚。

Rossing等［13］是利用蛋白质组学技术寻找 DN生物标志物的成功范例，他将305例尿标本分成检测组和验证组，采用高解析毛细管电泳联合电喷雾质谱法分析结果发现，由40种尿生物标志物构成的模型，能够将糖尿病与健康个体区分出来(敏感度89%，特异度91%)。糖尿病伴正常白蛋白尿患者与DN患者有102种尿生物标志物有显著差异，采用take－one－out程序证实，由65种生物标志物构成的模型能够非常灵敏地将DN从糖尿病中识别出来(敏感度97%，特异度97%)。另外，由17种标志物构成的模型，可以把DN和其他四种肾脏病区别出来(IgAN，FSGS，MN 和 MCD)，其敏感度81%，特异度91%。对上述65种标志物构成的模型，进一步进行了多中心验证，研究纳入了148例病程≥5年的T2DM患者(包括65例DN和83例无肾病的糖尿病患者)结果发现，其诊断 DN的敏感度达93.8%，特异性91.4%［14］，从而证实该方法有较好临床价值。这些异常的标志物中，上调的成分包括a1抗胰蛋白酶片段等，下调的成分包括胶原a1片段等［14］。该模型的临床价值还需要更加广泛地验证和深入地探讨。

此外也有作者利用动物模型来探索DN的生物标志物。例如Fugmann等［15］用链脲佐菌素(STZ)诱导的1型DN大鼠模型，取其肾组织，通过蛋白质组学技术发现，Vanin 1蛋白质在DN肾组织中高表达，且结果通过免疫组织化学方法得到证实，遗憾的是在糖尿病伴或者不伴白蛋白尿的两组患者中无显著差异。

总之，DN生物标志物的研究取得了一些积极的进展，但仍需做大量的基础和临床工作。除了采用新技术发现一些新的生物标志物外，采用新的生物信息学方法对已有的信息进行整合分析，也是一个重要的研究方向。例如Fechete等［16］采用通路分析方法对已经报道采用各种“组学”技术发现的可能的DN生物标志物以及参与DN病理生理过程的所有基因(共超过1 000个基因)分析发现，参与补体和凝血通路，过氧化物酶体增生物活化受体(PPAR)通路和肾素－血管紧张素系统(RAS)通路中的多个基因可以作为疾病的生物标志物，同时，其中一些蛋白质也是目前的治疗靶点。利用新的技术平台、方法和思路，进一步深入研究，不但可以找出更多更理想的生物标志物，还可能揭示DN的发病机制，并为治疗提供新靶点。

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15 Fugmann T，Borgia B，Révész C，et al.Proteomic identification of vanin－1 as a marker of kidney damage in a rat model of type 1 diabetic nephropathy.Kidney Int，2011，80(3):272 －281.

16 Fechete R，Heinzel A，Perco P，et al.Mapping of molecular pathways，biomarkers and drug targets for diabetic nephropathy.Proteomics Clin Appl，2011，5(5 －6):354 －366.