非小细胞肺癌患者癌组织、外周血中hnRNP A2/B1 mRNA的表达变化

龙颖颖，古 艳，李 羲，颜春松

(1南昌大学第二附属医院，南昌330006;2南昌大学第三附属医院;3海南医学院附属医院)

肺组织病理学检查是诊断肺癌的金标准，但该检查为有创操作，可能导致患者病情加重，且部分肺癌晚期患者难以取得癌组织标本。因此，寻找一种无创且有助于肺癌早期诊断的方法具有重要意义。随着分子生物学的迅猛发展，越来越多的学者将研究的重点转向肿瘤标志物的监测，现在已发现与肺癌有关的肿瘤标志物有10余种。异质性胞核核糖核蛋白A2/B1(hnRNP A2/B1)是一种癌生长蛋白，与非小细胞肺癌(NSCLC)的发生发展密切相关［1］。本研究观察了hnRNP A2/B1基因在NSCLC患者外周血单个核细胞及癌组织中的表达变化，并探讨其意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 NSCLC患者37例(肺癌组)，男29例、女8 例，年龄(63.49±13.76)岁;均未行放化疗及其他抗肿瘤治疗，于2009年12月～2011年12月行手术治疗留取癌组织，经病理检查确诊。其中鳞癌26例，腺癌8例，大细胞癌2例，肉瘤1例;TNM分期Ⅰ～Ⅱ期16例，Ⅲ～Ⅳ期21例。肺部良性病变20例(良性组)，男16例、女4例，年龄(57.32±15.69)岁;其中间质性肺炎16例，肺囊肿4例。两组性别、年龄具有可比性(P均＞0.05)。

1.2 hnRNP A2/B1基因检测方法

1.2.1 RNA的提取 取100 mg新鲜肺病变组织标本匀浆，加1 mL Trizol混匀，室温放置5 min;加入氯仿0.2 mL，剧烈震荡15 s，室温放置3 min。4℃10 000 r/min离心15 min，样品分成黄色的有机相、中间层和上层无色的水相。把水相移到新EP管中，加入等体积异丙醇，混匀，-20℃放置20 min。4℃ 10 000 r/min离心10 min，去上清可见白色絮状物即RNA。加入75﹪乙醇1 mL(用无核酶水配置)洗2次。室温放置晾干，加入无核酶水20 μL充分溶解RNA，电泳检测提取RNA的质量及效果。取1 mL新鲜血液加入3 mL红细胞裂解液，混匀后室温放置10 min，4℃ 10 000 r/min离心5 min，弃上清，收集白细胞沉淀。在白细胞沉淀中加入1 mL Trizol混匀，15～30℃放置5 min，使核酸蛋白复合物完全分离;4℃ 10 000 r/min离心10 min，取上清。后续步骤同肺病变组织RNA的提取。

1.2.2 RT-PCR 取 RNA 10 μL，用 0.05 μg/μL Oligo(dT)15 Primer 2 μL 及无核酶水 2 μL 混匀。快速加入 5 × M-MLV Buffer 5 μL、M-MLV 1 μL、Rnasin 0.5 μL、dNTP 1 μL 及无核酶水 3.5 μL 后混匀，42℃水浴60 min获得cDNA产物。以cDNA为模板进行hnRNP A2/B1及 β-actin的 PCR反应。具体操作:室温下加入 cDNA 模板 5.0 μL，hnRNP A2/B1 Primer(10 μM)1.0 μL，β-actin Primer(10 μM)1.0 μL，2 × Taq PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 5.5 μL，共计25 μL，置 PCR 仪进行扩增。反应条件:94℃预变性5 min，94℃变性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸2 min，共35循环，最后72℃延伸7 min。取 PCR 产物10.0 μL及 DNA Marker 5.0 μL于2%琼脂糖凝胶中进行电泳。将电泳产物切胶回收并纯化，用10 μL三蒸水溶解，取1 μL用核酸蛋白测定仪检测hnRNP A2/B1基因。

1.3 统计学方法 采用SSPS13.0统计软件。所得数据以±s表示，组间比较用t检验;相关性分析采用直线相关分析法。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

肺癌组癌组织与外周血单个核细胞中hnRNP A2/B1 mRNA 分别为(0.82±0.49)、(0.69±0.48)μg/μL，良性组分别为(0.16± 0.25)、(0.13±0.20)μg/μL;两组比较，P 均 ＜0.05。NSCLC 患者TNM分期Ⅰ～Ⅱ期者癌组织与外周血单个核细胞中 hnRNP A2/B1 mRNA 分别为(0.68±0.45)、(0.57±0.47)μg/μL，均低于Ⅲ ～ Ⅳ期的(0.93±0.49)、(0.78±0.4)μg/μL(P 均 ＜0.05)。肺癌患者癌组织与外周血单个核细胞中hnRNP A2/B1 mRNA 的表达呈正相关(r=0.941，P ＜0.05)。

3 讨论

hnRNP是一组核内RNA结合蛋白，是由30多个蛋白质小分子构成的复合体，其功能主要与RNA转录、外显子剪接、剪接位点选择以及Pre-mRNA的成熟和降解有关［2］。hnRNP A2/B1是hnRNP的主要组成部分，它可在核内连接前RNA，并在RNA处理和连接位点的选择中起重要作用;此外，hnRNP A2/B1可在核与胞质间穿梭，具有将mRNA输出到胞质的功能;hnRNP还参与RNA的代谢、转录和DNA 复制［3～5］。hnRNP A2/B1 在正常肺发育的关键阶段过度表达，表达水平与肺癌及癌前病变类似，其在成熟肺组织中的表达被抑制;在肺癌中的表达形式类似于胚肺生长中所见，这种表达形式在蛋白质和信号分子水平是一致的，表明hnRNP A2/B1可能是一种癌生长蛋白。

本研究表明，在Ⅰ～Ⅱ期肺癌组织与外周血单个核细胞中hnRNP A2/B1 mRNA均高于良性组，提示肺癌早期已出现hnRNP A2/B1异常表达，有助于肺癌的早期诊断，与相关报道一致［6，7］;肺癌组患者癌组织与外周血单个核细胞的hnRNP A2/B1表达呈正相关(r=0.941，P ＜0.05)，其原因为早期肺原发灶肿瘤生长代谢过程中因细胞坏死释放hnRNP A2/B1 mRNA入血，且肺部血液循环非常丰富，hnRNP A2/B1 mRNA很快随着血液循环到达全身。因此，检测外周血单个核细胞hnRNP A2/B1即可反应病变组织中该因子的变化，可作为一种有助于NSCLC的早期诊断及病理分期的肿瘤标志物。此外，外周血标本容易获取，创伤较小，且PT-PCR技术相对于现今复杂的分子技术而言操作和硬件设备要求相对简单，一般三甲医院临床实验室均有检测条件，因此对疑似NSCLC患者早期检测外周血单个核细胞中的hnRNP A2/B1基因具有临床可行性［8～10］。

［1］Montuenga LM，Zhou J，Avis I，et al.Expression of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1 changes with critical stage of mammalian lung development［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，1998，19(4):554-562.

［2］Moran-Jones K，Wayman L，Kennedy DD，et al.hnRNP A2，a potential ssDNA/RNA olecular adapter at the telomere［J］.Nucleic Acids Res，2005，(33):486-496.

［3］Nakielny S，Fischer U，Michael WM，et al.RNA transport［J］.Ann Rev Neurosci，1997，20(3):269-301.

［4］Nichols RC，Wang XW，Tang J，et al.The RGG domain in hnRNP A2 affects subcellular localization［J］.Exp Cell Res，2000，256(2):522-532.

［5］Kozu T，Henrich B，Schöffer KP.Structure and expression of the gene(HNRPA2B1)encoding the human hnRNP protein A2/B1［J］.Genomics，1995，25(2):365-371.

［6］Tockman MS，Gupta PK，Myers JD，et al.Sensitive and specific monoclonal antibody recognition of human lung cancer antigen on preserved sputum cells:a new approach to early lung cancer detection［J］.J Clin Oncol，1988，6(11):1685-1693.

［7］Tauler J，Zudaire E，Liu H，et al.HnRNP A2/B1 modulates epithelial-mesenchymal transition in lung cancer cell lines［J］.Cancer Ras，2010，70(18):7137-7147.

［8］Lu ZT，Fu Q，Geng M，et al.Expression and its research of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1 in non-small cell lung cancer［J］.Prac J Med Pharm，2003，20(3):161-163.

［9］Jing GJ，Xu DH.Aberrant expression and localization of hnRNPA2/B1 is a common event in human gastric adenocarcinoma［J］.J Gastroenterol Hepatol，2011，26(1):108-115.

［10］Pino I，Pio R，Toledo G，et al.Altered patterns of expression of members of the heterogeneous nuclear ribonucleoprotein(hnRNP)family in lung cancer［J］.Lung Cancer，2003，41(2):131-143.