浅谈抗菌肽的抗菌活性

陈绍平，赵建乐

（1.赤峰农牧学校，内蒙古赤峰024031；2.天津瑞普生物技术股份有限公司，天津300308）

抗菌肽（ABP）又称为抗微生物肽（AMP）、宿主防御肽(HDPs)、肽抗生素，是动物免疫防御系统在外界条件刺激下，产生的一类对抗外源性病原体致病作用的具有免疫活性的多肽，是动物非特异性免疫防御系统的一个重要组成部分。依据其物种来源的不同，被分别命名为防御素、蛙皮素和蜂毒素等。抗菌肽有着分子量小、活性强、功能广泛、杀菌谱广等特点。抗菌肽的分子量一般在4kDa左右，肽链由12～50个氨基酸残基组成，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、螺旋体、病毒(如流感病毒、疱疹病毒、人类HIV病毒)等均具有很强的杀伤活性。抗菌肽可以相对独立地发挥抗菌功能，如果与其它因子（其它抗菌肽、乳铁蛋白、溶菌酶等）协同作用，活性会明显提高。目前，抗菌肽已成为免疫学和分子生物学研究的热点。迄今为止，国内外分离鉴定的天然抗菌肽已经超过900种，并对多种抗菌肽进行了cDNA克隆测序、原核表达、真核表达，以及转基因动物表达。本文根据当前各种抗菌肽的报道，通过比较不同种类抗菌肽的抗菌活性差别，对影响其抗菌活性的因素作一综述。

一、不同种类抗菌肽的抗菌活性

1.昆虫抗菌肽。昆虫抗菌肽属阳离子碱性多肽，可分为五种类型。①天蚕素，最早从天蚕的免疫血淋巴中分离得到，有A、B、C、D 4种类似体。目前已从鳞翅目和双翅目昆虫中分离出20多种天蚕素类抗菌肽,对各种大肠杆菌和其他革兰氏阴性菌具有很强的活性，对革兰氏阳性菌的杀灭作用比革兰氏阴性菌弱，但对霉菌和其他真核细胞没有细胞毒性作用。柞蚕抗菌肽对约40多种细菌有明显杀灭效果，其中包括绿脓杆菌、金黄葡萄球菌、大肠杆菌及副伤寒杆菌耐药性株等。通过在细菌细胞膜上形成电势依赖性通道，改变细胞膜的通透性，造成细菌因细胞内容物外泄而死亡。②昆虫防御素，最早是从半翅目昆虫肉蝇中分离得到，曾一度被认为与哺乳动物的防御素同源而命名为昆虫防御素，但二者的二硫键的连接方式以及三维空间构型截然不同。除双翅目昆虫外，在半翅目、鞘翅目、膜翅目、毛翅目和蜻蜓目昆虫中都发现了昆虫防御素。主要抗革兰氏阳性菌，而对革兰氏阴性菌、真菌及真核细胞几乎无效，不引起血细胞溶血效应，其抗菌机制与天蚕素相似。③富含脯氨酸类抗菌肽，最早是在膜翅目的意大利蜂中发现。在鳞翅目、双翅目、半翅目、鞘翅目昆虫中也有发现。如存在于蜜蜂血淋巴中的Apidaecin和Abaecin，来自果蝇的Drosocin，来自无翅红蝽的Pyrrhocoricin及来自碧蝽的Metalnikonins。该类抗菌肽主要作用于革兰氏阴性菌，而对革兰氏阳性菌没有作用，其抗菌机理尚不清楚。④富含甘氨酸类抗菌肽，是近几年才从天蝇、麻蝇中发现的一类抗菌肽。在鳞翅目、双翅目、半翅目、鞘翅目、膜翅目昆虫中都有发现，如从天蚕中分离的凝集素、来源于双翅目昆虫的双翅肽，它们的抗菌谱较广，推测此类抗菌肽中含量很高的甘氨酸可能对提高肽链弹性和广谱抗菌机制起重要的作用。⑤ 抗真菌肽(AFP),最先是从麻蝇中分离出一种抗菌肽命名为AFP，随后又发现了结构相似的holotricin。可抵抗真菌的感染，尤其是由白色念珠菌造成的感染，抗真菌肽可通过细胞ATP的非裂解性释放来杀死真菌，释放的ATP随后与嘌呤功能受体结合，激活细胞毒性路径。

2.哺乳动物抗菌肽。哺乳动物抗菌肽由骨髓细胞或上皮细胞产生，有着十分广泛的抗菌谱。六个保守的半胱氨酸形成的三个稳定的二硫键，是区别于其他抗菌肽的主要特征之一。哺乳动物的抗菌肽包括：上皮组织中的防御素、呼吸道中的表面活性物质阴离子抗菌肽（SAAPs）以及大量存在于白细胞中的Cathelicidins。其中Cathelicidins是一类具有宽抗菌谱、高效杀灭细菌活性的抗菌肽，能在微摩尔浓度有效杀灭细菌。猪的抗菌肽有，在小肠的潘氏细胞中分离到 的 PR-39、Cecropin P1和 NK-lysin；骨髓中分离到的PMAP；白细胞中分离到的PGs。牛的抗菌肽包括，在气管上皮发现的TAP和舌上皮的LAP，两者均属于防御素家族；以及存在于嗜中性粒细胞的Bac7、Bac5、Bactencin、β-defensins、indohcidin等。人的抗菌肽种类很多，多数属于防御素类，而hCAP-18是迄今在人体发现的Cathelicidins家族的唯一成员。hCAP-18酶解后释放出的LL-37，在人体组织中广泛分布，具有广谱抗微生物作用、中和内毒素作用和趋化作用，是人体天然免疫的重要多功能分子。兔的MCP-1和MCP-2，由肺巨噬细胞产生，属于防御素家族，同样具有广谱的抗菌活性。

猪的Cecropin P1是第一个从肠组织分离到的抗菌肽，与昆虫的天蚕素Cecropin A和Cecropin B分别有64%和75%的同源性，泌尿生殖道正常生长的乳酸杆菌对其有高度抗性，且与牛的indolacidin、蛙的buforin Ⅱ及一些抗生素联合用药无协同作用；PGs可抗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌等多种性传播病菌，其中PG-1具有广谱的抗细菌和真菌的作用，可在体外杀死很多革兰氏阴性菌如大肠杆菌、铜绿假单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌等。PR-39在低浓度下可以抗革兰氏阴性菌(如大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌菌)、革兰氏阳性菌(如巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、酿脓链球菌、结核分支杆菌)，不裂解野生型大肠杆菌，但对突变型K12有作用，通过阻断细菌蛋白质和DNA的合成，从而导致这些成分的降解。牛的Bac7，Bac5属于Cathelicidins类抗菌肽，两者的氨基酸序列与人、兔、大鼠的防御素类抗菌肽无同源性，也不同于蛙皮素和天蚕素；Bactenecin是环状的十二肽，在分子的中部形成一个环链，对野生型革兰氏阴性菌特别敏感，与脂多糖有很高亲和力，从而有利于渗透细菌外膜，抗菌活性强；从羊白细胞分离到的OaBac5、ChBae5与牛的Bac5同源，并在低盐浓度下仍有抗菌活性，这类Bac 5在反刍动物中高度保守，对于其先天防御体系有利。

3.蛙类的抗菌肽。目前发现的蛙类抗菌肽种类很多，有蛙皮素、Bombinin-likes、Brevinins,以及从澳洲蛙类中提取到的抗菌肽：Caerins、Citropins、Maculatins、Uperins等。蛙皮素是一组非洲蟾蜍皮肤中的广谱抗菌肽,对于细菌、真菌、酵母以及原生生物都有作用，MagaininⅡ是一个代表性的抗菌肽，它与细菌细胞膜中阴离子脂静电识别，形成肽-脂超分子复合物孔道，但由于MagaininⅡ疏水性较低，不能和组成哺乳动物细胞膜的两性离子磷脂有效结合，所以对正常真核生物细胞低毒。青蛙皮肤产生的Brevinins，有较强的抗菌活性。CaerinⅠ是一组从几种树蛙中分离得到的具有广谱抗菌活性的抗菌肽，结构和功能的研究都较为清楚。

4.水生动物抗菌肽。水生动物的抗菌肽包括鱼类抗菌肽和水生甲壳动物抗菌肽。鱼类抗菌肽不仅具有抗菌作用，而且是美容营养成分，具有用于化妆品的独特优势和广泛的市场潜力。同一种鱼的不同组织会产生不同的抗菌肽，且不同的鱼类，抗菌肽的差异很大，所以鱼类抗菌肽的种类非常多且同源性不大。依据它们在结构上的一定共性和特点归为四种类型：①不含半胱氨酸，可以折叠成疏水或双亲性α螺旋结构。主要有Pardaxin和Misgurin。Pardaxin是豹鳎体表粘液中的抗菌肽，活性比蜂毒素更强，溶血活性更低；Misgurin是泥鳅体内的抗菌肽，有较强的体外广谱抗菌活性且没有明显的溶血作用，其抗菌活性是蛙皮素magaininⅡ的6倍以上。此外，虹鳟的Salmocidin，美洲黄盖鲽的Pleurocidin也属于这一类。②含有多个半胱氨酸，可以折叠成β结构。如虹鳟的Hepcidin。③分子结构与组蛋白高度相似的组蛋白样蛋白(HLPs)。如鲶的Parasin I，斑的3种HLPs，鲑鱼的SAM 都同属此类抗菌肽。其中，Parasin I无溶血作用，广谱抗菌，且活性是蛙皮素的12～100倍。④具有糖基化修饰的抗菌肽。

水生甲壳动物（如虾、蟹、鲎）的抗菌肽不仅具有抗菌作用而且具有与几丁质结合的活性。从青园蟹中分离到的3种抗菌肽，与牛的Bactenecin-7高度一致；从鲎分离到的抗菌肽，类似于兔和牛的防御素；从南美白对虾中分离出的3种抗菌肽Penaeidins，是独特的带负电荷抗菌肽，主要抗革兰氏阳性菌和真菌。

5.细菌抗菌肽。已发现的细菌抗菌肽包括：杆菌肽、短杆菌肽S、多黏菌素E、乳链球菌肽（Nisin）。杆菌肽主要作用于革兰氏阳性菌，通过抑制革兰氏阳性菌胞浆内的肽聚糖前体转变为焦磷酸萜醇，从而起到抑菌作用，对耐药的金黄色葡萄球菌、肠球菌、链球菌、螺旋体、放线菌有效，但对革兰氏阴性菌无效；而短杆菌肽S对革兰氏阴性菌和白色念珠菌具有很强的活性。多黏菌素E能通过破坏细胞膜而起到杀菌作用，对大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、布鲁氏菌、弧菌、痢疾杆菌、绿脓杆菌等均有效，尤其对绿脓杆菌具有强大的杀菌作用，应用黏杆菌素气雾剂治疗肺部绿脓杆菌感染已取得成功。乳链球菌肽，是lantibiotic类抗菌肽，通过抑制细菌蛋白质合成起到抑菌作用，若与EDTA共用可提高对革兰氏阳性菌的抑制效果；与乳铁蛋白结合亦可更好地抑制单增李斯特氏菌。

二、抗菌肽的抗菌机制

抗菌肽的多种抗菌途径使得抗菌肽的杀菌过程非常迅速，一般不超过5分钟。目前，被国内外认可的抗菌机制有：抗菌肽的膜裂解机制和非膜裂解机制。膜裂解机制是指抗菌肽疏水端有插入细菌质膜的倾向，进而形成受电动势调节的孔洞，使膜的完整性受损，通透性增加，引起胞内水溶性物质大量渗出，从而最后导致细菌死亡。目前还有栅桶式、胶粒聚合和毯式，三种对于膜裂解机制的补充解释。随着研究的深入，人们还发现了抗菌肽的非膜裂解的抗菌机制：①诱导细胞调亡。②攻击线粒体。③影响细胞染色体。④抑制细胞外膜蛋白和细胞壁的形成。目前发现的抗菌肽多种作用机制中，膜裂解机制被认为是最主要作用途径，且一种抗菌肽可以通过多种途径来发挥作用。

三、影响抗菌肽抗菌活性的因素（略）

四、结语

抗菌肽的抗菌活力很高，具有着取代抗生素的独特优势和广泛的市场潜力。但是，若要抗菌肽真正成为商品化药物，还有很多问题需要解决：

（1）如何提高抗菌肽的产量及降低成本，已成为目前抗菌肽投入大规模生产应用的瓶颈。直接从动植物组织中分离提纯分子量较小的天然抗菌肽，存在一定的困难，而合成肽价格又太昂贵。因此，人们期望利用基因工程将抗菌肽基因转化进微生物表达系统或导入动植物体内，以改造物种获得优良抗病品种。

（2）需要深入研究结构与功能的关系，设计更高生物活性的抗菌肽分子。天然抗菌肽的抗菌活性还不够理想，但是，抗菌肽的氨基酸残基数量少，结构特点鲜明，易于合成，便于改造，可以通过对现有抗菌肽及其衍生物进行化学修饰；或者，组装新型肽类合成模板，来得到更多抗菌肽骨架化学结构；或者，利用得到的化学结构为母体进行化学合成。以上这些方法都需要进一步研究抗菌肽的结构与活性之间的关系，为抗菌肽分子的改造和设计提供足够的理论依据。

（3)抗菌肽的安全性问题。抗菌肽的使用安全性研究至今尚无资料表明抗菌肽的体内外毒性问题。许多天然抗菌肽都有溶血作用，并且一些抗菌肽如蜂毒素、蜂毒肽、蝎毒素、植物抗菌肽等对正常真核细胞具有潜在的毒性。

（4）关于抗菌肽的药效学、药代动力学及体内应用的稳定性的研究还很少，抗菌肽代谢的半衰期及代谢产物是否对机体体有害还不清楚，而且不能确定肽类物质在被吸收入血流后，是否会被血流内的蛋白水解酶降解。人们正在尝试，通过应用前体药物、结合耐蛋白水解酶的肽类或进行序列修饰等方法来解决其稳定性的问题。

随着对抗菌肽研究的进一步深入，可以设计出具有特定性质的新型抗菌肽，验证其抑菌活性，进行毒理学研究之后，用基因工程的方法获得大量的产品，不失为新药开发的一条捷径，并有望开发高效低毒的小分子抗菌肽。

（略）