基因芯片技术在中医药研究中的应用进展

陈 斌

利川市人民医院康复科(湖北 利川 445400)

随着人类基因组计划的完成，人类正从结构基因组学(Structural genomics)进入功能基因(Functional genomics)和功能蛋白质组(Functional proteomics)时代[1]，也促进了基因芯片技术、生物信息学技术等与中医药研究有关的高新技术的发展。其中，基因芯片技术以高通量、高集成、多样化和自动化等特点而被广泛应用于中医药各领域的研究中。现对基因芯片技术在中医“证侯”、中药和针刺机制研究中的应用取得的一些成果进行综述。

1 基因芯片技术

基因芯片(genechip)(又称DNA芯片、生物芯片)是根据核酸互补杂交原理而研制出来的[2]。基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，在固相支持物表面固定序列已知的核苷酸的分子探针，组成微阵列，利用核酸杂交原理，然后进行荧光共聚焦检测，最后通过计算机软件比较和统计分析后，可对大量基因的表达水平、突变和多态性进行快速、并行、准确、高效地检测分析[3]。且一块芯片一次杂交可以对成千上万个基因的表达情况进行分析，形成完整的基因表达谱，目前已成为基因表达分析的最常用的工具[4]。

近年来,基因芯片技术已经应用于中医药研究各领域，主要体现在中医中证候研究、中药作用机理研究、中药有效成分筛选、中药药材鉴定及探索针刺作用机制等方面，并取得了一定成果。

2 基因芯片技术在中医“证”研究中的应用

辨证论治是中医诊断和治疗疾病的主要手段之一，辩证是论治的前提，所以证是中医学中的重点、难点和热点。所谓证是指在疾病发展过程中，某一阶段的病理概括，它包括原因、病的部位、病的性质、和邪正关系，反映了疾病发展过程中，该阶段病理变化的全面情况[5]。但证的本质研究一直未取得实质性的进展，因为简单的证，也会影响到人体全身各个系统、组织及细胞，引起非常复杂的变化。

建立中医“证”的基因表达谱，将是21世纪中医药学的主要发展趋势[6]。利用基因芯片的多态性表达技术，对用传统中医方法确诊的证进行基因表达谱的建立，推断表达谱基因的相互关系，揭示证与基因的实质关系，有可能从分子水平揭示证的本质。柴可夫等[7]用基因芯片检测2型糖尿病中医湿热困脾证的基因表达,通过基因芯片检测发现其和健康人表达差异的基因共38条，其中上调的基因有24条，下调的基因有14条。并发现湿热困脾证的特异性基因。潘志强等[8]用基因芯片检测肝癌小鼠早期邪毒壅盛证和气虚证、中期阳气虚证、中晚期气阴阳虚证三个阶段4个征候肾上腺素基因表达的差异，结果筛选到不同阶段一致上调的基因73个，一致下调的基因26个。吴远胜等[9]用基因芯片技术对系统性红斑狼疮患者基因差异表达进行了检测分析，共发现了16大类580条基因有显著差异表达，其中热毒炽盛型和阴虚内热型大部分基因与代谢相关的基因表达有一致性。倪红梅等[10]基因芯片技术术筛选，分析青少年肾阳虚体质者外周血白细胞的差异表达基因，共筛选出127条符合标准的差异表达基因，其中63条呈上调表达，64条呈下调表达。与青少年肾阳虚体质相关的基因表达涉及到免疫相关、发育相关、细胞生长、细胞受体、细胞信号和传递蛋白、蛋白翻译合成等，其中，CCNH基因与PSMB7基因的表达差异最大，提示这两条基因可能与青少年肾阳虚体质密切相关。这些均说明基因表达差异与证候是有关联的。

3 基因芯片技术在中药研究中的应用

3.1中药作用机理研究由于化学药品毒副作用的不断增强，人们把眼光也逐渐转向了天然的中药药物治疗。因其缺乏科学的理论支持，中药复杂的作用机制至今仍是中药国际化的瓶颈。基因芯片技术以其高通量、并行、高内涵的优势为探索中药作用机理等现代中药研究开辟了崭新的领域[11]。利用基因芯片确定靶组织的基因表达模式，可将中药作用的所有靶基因全部显示出来，从而为揭开中药作用机制提供了有效的依据。于华芸等[12]利用基因芯片技术探讨寒性中药大黄清热泻火解毒的作用机制。通过基因表达谱结果与生物信息学分析发现大黄组与正常对照组比较有398条基因差异表达。并发现2个显著性基因功能亚类：防御反应，涉及21条差异基因；脂代谢过程，涉及11条差异基因，主要参与花生四烯酸代谢过程。调控机体防御反应、花生四烯酸代谢相关基因表达，可能是大黄发挥清热泻火解毒作用的分子机制之一。祁冰等[13]应用基因芯片技术分析丹参提取物——隐丹参酮对胰岛素抵抗卵巢颗粒细胞基因表达的影响，共筛查出42个差异基因，其中22个基因表达下调，20个基因表达上调。研究表明，隐丹参酮可以通过调节多个基因、作用多个信号途径来改善胰岛素抵抗卵巢颗粒细胞的状态。

3.2中药有效成分的筛选中药的有效成分及其作用机制非常复杂，不管是单方和复方。由于技术手段的限制，传统的物理和化学方法提取出来的中药成分的药理作用不明，而且利用传统的药理筛选方法来筛选中药的有效成分，耗时长、工作量大、效率低，研究经费高。如果利用基因芯片的高通量、平行快速检测的特点来筛选中药的有效成分，可避免大量动物实验，缩短药物筛选所需要的时间和周期，节约实验经费。利用基因芯片技术对中药或者中药某些成分进行分析，可将中药的成分与基因表达相关联，通过分析比较不同药物成分对基因表达谱的 影响，确定发挥药效的部分。据报道，香港科技大学生物技术研究所利用基因芯片技术已经筛选到知母的23种有效成分[14]。Hara等[15]利用基因芯片分析抗肿瘤草药黄连根及其8个组成分子的12600个基因，经过生物信息学技术处理，已经确定黄连中抗增殖的有效成分是黄连素。

3.3中药药材鉴定准确地鉴定中药药材是保证中药临床用药安全准确有效的前提。我们过去常依据药物的来源、性质等基本特征进行鉴定，但各有局限性，因而难于满足中药鉴别的需要。有学者提出利用生物芯片技术可对中药的基因进行鉴定。应用基因芯片技术可实现中药品种快速、准确、自动化鉴定，保证临床用药的安全性与有效性。如果将中药材某些特异基因测序完成后，可将各种中药材的特异基因的特异核苷酸序列探针做成基因芯片，就可以非常准确地鉴别药材的真伪。Zhang YB等[16]利用基因芯片技术对中药石斛的不同种属进行了鉴别，将16个不同种属石斛的ITS1-5．8S．ITS2序列固定于玻片上制作了基因芯片，并用荧光标记的ITS2序列作为探针，可检测出5种被记载的石斛。

4 基因芯片技术在针刺研究中的应用

随着针灸的不断发展，其作用机制成为近来研究的热点，揭示针刺作用机制能够更好的提高其临床疗效。针灸作用于人体后，能引起人体神经、内分泌、免疫，消化等多个系统的反应，但针灸的信号是如何在细胞内外传递的过程仍不清楚；此外，不同的针刺条件，比如不同的频率、幅度、时间，强度等会产生不同的疗效。针刺作用机制的研究一直没有太大的进展，如果利用基因芯技术可检测针刺时细胞内外基因表达的差异，再利用蛋白组学、生物信息学等技术进行分析，有可能揭示针刺作用机制。杨丽萍等[17]用基因芯片技术检测肾阳虚证骨关节炎患者及压正常人的基因表达谱，以及针灸治疗显效者的治疗前后基因表达谱的变化。结果筛选出与肾阳虚骨关节炎免疫相关的基因13条，肾阳虚骨关节炎患者与正常人相比表达下调4条，上调5条。通过对13条免疫相关基因的功能分析，初步认为肾阳虚骨关节炎的发生涉及多种免疫相关基因，温针灸可能是通过调控多基因的表达来实现其治疗作用。王米渠等[18]应用基因芯片研究针刺涌泉穴对D一半乳糖所致衰老大鼠基因表达的影响，初步筛选出了差异表达基因318条，其中表达上调的有137条，表达下调的有181条，并对其中差异最为显著的55条作了初步分析。针刺涌泉穴对衰老大鼠的基因表达的影响涉及免疫、生长发育、基础代谢和细胞骨架运动等多个方面，这从基因水平证明了针刺治疗是一整体调节作用。

5 结论

基因芯片技术以其自身的优点被广泛应用于中医药各领域的研究中，它使中医药的发展和研究更加现代化、标准化、客观化，准确化。虽然基因芯片技术费用相对昂贵，技术手段还处于探索研究阶段，部分芯片特异性、敏感度相对较低等因素局限了其在中医药各领域的应用和发展，但其在中医证基因表达差异分析、中药作用机制、中药筛选及针刺机制研究等方面已发挥出重大作用，为我们更好地研究祖国医药开辟了一条新的道路，所以仍有广阔的发展和应用前景。随 着生物信息学的发展，基因芯片技术会在生命科学研究的更多方面显示出它的价值，也会更好的促进中医药现代化发展。

[1]武瑞，连学昭．基因芯片技术在中药研究中的应用[J].中兽医医药杂志，2005，24(1)；21-23.

[2]Chen MH,Ibrahim JG，Chi YY．A new class of mixture models for differential gene expression in DNA microarray data[J].J Statist Planning Infer，2008，138(2)：387.

[3]Pal NR，Aguan K，Sharma A，et al．Discovering biomarkers from gene expression data for predicting cancer subgroups using neural networks and relational fuzzy clustering[J].BMC Bioinformatics，2007，8(5)：1.

[4]JainKK．Bioehlp h gone spotting[J].Science,2001,294(5542):621-623.

[5]吴敦序，刘燕池，李德新，等．中医基础理论[M].上海：上海科学技术出版社，2004:7.

[6]沈白尹．基因科学和21世纪中医药学的走向[J].上海中医药杂志，2000(10)：7-9.

[7]柴可夫，黄晓玲，钱俊文,等．2型糖尿病中医湿热困脾证的基因表达研究[J].浙江中医药大学报,2009,35(5):688-692.

[8]潘志强，方肇勤，卢文丽，等．肝癌小鼠不同阶段有关证候肾上腺差异表达的基因分析[J].中西医结合学报,2008,6(8):843-851.

[9]吴元胜，范瑞强．陈红，等．基因芯片技术分析SLE证候基因表达的初步研究[J].现代中西医结合杂志,2003,16(12):1683.

[10]倪红梅，何裕民，方盛泉，等．青少年肾阳虚体质差异表达基因的筛选研究探析[J].江苏中医药,2007,39(10):26-28.

[11]荆志伟，王忠，高思华，等.基因芯片技术与中药研究——中药基因组学中国中医科学院[J].中国中药杂志，2007,2(4).

[12]于华芸，王世军，季旭明，等．基因芯片技术研究大黄“ 清热泻火解毒”作用机制[J].世界中西医结合杂志,2010,5(7):572-575.

[13]祁冰，宋家欣，杨琳，等.基因芯片研究隐丹参酮对胰岛素抵抗卵巢颗粒细胞基因表达的影响[J].科技导报，2009,27(15):39-43.

[14]徐仿周，吴继洲.基因芯片技术在中药中的应用研究进展[J].国外医学药学分册[Foreign Med Sci(section of Pharamcy)],2005,32(15):300-305.

[15]Hsrs A，Iizuka N，Hamamoto Y，et al.Molecular dissection of amed icinal herb with anti-tumor activity by oligonucleotide microarmy[J].Lifo Sci，2005，77(9)：991.

[16]Zhang YB，Wang J，Wang Zr，et al.DNA microarray for identiflcation of the herb of dendrobium species from Chimedicinal[J].

[17]杨丽萍，王明臣，王米渠，等．基因芯片技术研究针灸对肾阳虚证骨关节炎患者免疫相关基因表达的影响[J].辽宁中医杂志，2006，33(3)：257-258.

[18]王米槊，张卫，李王民，等．基因芯片筛选针刺衰老鼠涌泉穴的318个差异表达基因初报[J].中国中西医结台杂志，2002，22(11)：928.