三江镇腌菜中降解亚硝酸盐乳酸菌的筛选和初步鉴定

刘志文，袁伟静，张三燕，罗 静，陈忠良，李昆太，郭晓燕，徐 波,*

(1.江西农业大学生物科学与工程学院，南昌市发酵应用技术重点实验室，江西 南昌 330045；2.北京市立新学校，北京 100037；3.南方医科大学第二临床医学院，广东 广州 510515)

三江镇腌菜中降解亚硝酸盐乳酸菌的筛选和初步鉴定

刘志文1，袁伟静2，张三燕1，罗 静3，陈忠良1，李昆太1，郭晓燕1，徐 波1,*

(1.江西农业大学生物科学与工程学院，南昌市发酵应用技术重点实验室，江西 南昌 330045；2.北京市立新学校，北京 100037；3.南方医科大学第二临床医学院，广东 广州 510515)

为筛选具有较强降解亚硝酸盐能力的乳酸菌，本实验经过初筛和复筛从三江镇雪里蕻腌菜中筛选出降解亚硝酸盐能力相对较强的乳酸菌菌株。筛选结果显示菌株对亚硝酸盐最强降解能力达到68h平均降解量32.66μg/mL。采用十六烷基三甲基溴化铵法(CTAB)法提取降解亚硝酸盐能力最强的乳酸菌11号菌株的基因组，测序后进行Blast同源性比较，其与Lactobacillus fermentum strain PL9005的同源性达到98%，并选取同源性较高的菌株构建系统发育进化树，初步鉴定该菌株为Lactobacillus fermentum。

乳酸菌；亚硝酸盐降解；筛选；鉴定

我国蔬菜年总产量数亿吨，蔬菜深加工是农民增收的有效途径，如传统发酵食品——酱腌菜是主要的蔬菜加工种类。食用酱腌菜除可吸收蔬菜营养成分外，同时还可摄入乳酸菌及其代谢产生的有机酸等，具有帮助消化，防止便秘，刺激肠道免疫细胞产生抗体，预防疾病，抑制肠道腐败细菌生长，减弱腐败菌在肠道产毒，防止细胞老化，降低胆固醇，调节人体生理功能等保健和医疗作用[1]。随着人们食品安全意识的提高，酱腌菜亚硝酸盐积累及有害微生物污染的安全性问题也日益受到人们的关注[2-3]。研究降解亚硝酸盐的方法和机理，对传统工艺进行创新和发明，提高酱腌菜的科技含量，完善酱腌菜工业化生产进程有重要作用，有利于我国传统酱腌菜走向世界[4-5]。

江西三江镇的传统特色食品“三江口萝卜腌菜”，色泽金黄、香气浓郁、酸辣适中、鲜香脆嫩，具有“酸、脆、香、辣”的独特风味，起源于宋代，是唐朝贡品，与四川榨菜、扬州酱菜等齐名，素有“一寸腌菜一寸金”之美誉，深受消费者喜爱。经检测发现其亚硝酸盐含量远低于一般市面上的酱腌菜中亚硝酸盐含量，因此本实验从三江镇腌菜中分离、筛选和鉴定降解亚硝酸盐的乳酸菌，为研究降低亚硝酸盐的机理，建立可控降解酱腌菜中亚硝酸盐的发酵体系，获得优质、安全的酱腌菜制品，以及新型酱腌菜的工业化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌种

前期实验从三江镇腌盐菜中分离、筛选得到17株乳酸菌，分离及鉴定方法参照文献[6]，由江西农业大学生物科学与工程学院保存。

1.2 仪器与设备

S3005060030型显微镜 江西凤凰光学仪器有限公司；WD-9403E型紫外分析仪、Spee-trAA-10型原子吸收分光光度计、DYY-6B型稳压稳流电泳仪 北京市六一仪器厂；高速冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂；DNA基因扩增仪 德国Biometra公司。

1.3 试剂的配制

MRS、H2S实验培养基、甲基红培养基、LB固体培养基的配制参照文献[7]；亚铁氰化钾溶液、乙酸锌溶液、饱和硼砂溶液、对氨基苯磺酸溶液、盐酸萘乙二胺溶液、亚硝酸钠标准溶液的配制参照文献[8]；TE、裂解缓冲液、溴化十二烷基三甲基铵(CTAB)的配制参照文献[7]；溶菌酶、蛋白酶K、RNase、Taq DNA聚合酶、dNTP 上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.4 方法

1.4.1 降解亚硝酸盐乳酸菌的初筛

将1.1节17株乳酸菌于MRS液体培养基中进行活化，取种龄为18h的菌种，按1‰接种量接种于200mL含125μg/mL NaNO2，pH6.0的MRS液体培养基中，30℃培养。于20、44、68h定时取样，检测发酵液中NaNO2含量，同时做不接种对照实验。

1.4.2 降解亚硝酸盐乳酸菌的复筛

将初筛得到的菌株于MRS液体培养基活化后，取种龄18h的菌种，接种于含适量NaNO2的磷酸钾、磷酸钠缓冲液的MRS液体培养基中，每隔24h定时检测发酵液中的NaNO2含量，同时做不接种培养基对照。

1.4.3 菌种鉴定

形态结构观察及生理生化实验参照文献[9]进行。

1.4.4 发酵液中亚硝酸盐含量的测定

采用GB/T 5009.33—2003《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中的盐酸萘乙二胺法对亚硝酸盐进行测定。

标准曲线绘制：分别准确称取0、1、2、3、4、5、7.5、10、12.5μg NaNO2，加入40mL水和2mL对氨基苯磺酸溶液，混匀，避光静置5min，再加入1mL盐酸萘乙二胺溶液，混匀并定容至50mL，避光静置15min，测OD538nm值。得标准曲线回归方程为：y＝0.6502χ-0.0058，R2＝0.995。

试样处理：将12.5mL饱和硼砂液加入于5.0mL发酵液中，再加入40mL蒸馏水后沸水浴加热15min，冷却至室温后加入5mL亚铁氰化钾溶液，再加入5mL乙酸锌溶液混匀。静置30min以沉淀蛋白质。将上述液体定容至100mL。过滤后，弃去初滤液5mL，收集剩余滤液备用。

样品测定：取2.00mL上述处理液加入40mL水，2mL对氨基磺酸溶液，混匀后避光静置5min，再加入1mL盐酸萘乙二胺溶液后定容至50mL后，避光静置15min，测OD538nm值，同时以等量蒸馏水做空白对照。

1.4.5 乳酸菌基因组DNA提取

采用十六烷基三甲基溴化铵法(CTAB)法提取乳酸菌的基因组DNA[7]。

1.4.6 16S rRNA菌种鉴定

将提取的乳酸菌基因组送交上海生工生物工程技术服务有限公司测序16S rRNA，根据得到的结果与GenBank中相关菌株基因组序列进行同源性比较。

1.4.7 构建系统发育进化树

根据测序所得的16S rRNA全序列在NCBI网站上进行Blast比对后，选取与目的序列同源性较高(最好是大于97%)的乳酸菌菌种序列，构建系统发育进化树。

2 结果与分析

2.1 降解亚硝酸盐乳酸菌的初筛结果

表1 初筛菌株发酵液中亚硝酸盐降解量Table1 Nitrite degradation ability of different lactic acid bacterium strains isolated from Sanjiang pickle pickled potherb mustard

由表1可看出，随着发酵时间的延长，发酵液中亚硝酸盐含量都有所降低。在同一时间，乳酸菌菌株不同，发酵液中亚硝酸盐降解量也不同。但由于乳酸菌在代谢过程中可产生乳酸，乳酸对亚硝酸盐具有一定的降解作用，故从以上菌株中选取68h平均降解量大于26.08μg/mL的菌株(5、9～16号)，接种于含磷酸盐缓冲液的MRS培养基中进行复筛。

2.2 降解亚硝酸盐乳酸菌的复筛

表2 培养液中亚硝酸盐降解量Table2 Nitrite degradation ability of primarily screened straμings/mL

由于含磷酸盐缓冲液的MRS培养基的pH值均始终维持在6.0以上，由张庆芳等[10]的研究结果可知，在pH4.5以上，乳酸菌对亚硝酸盐的降解作用主要以其代谢产生的酶降解为主，结合本实验表2结果可判断，经复筛的乳酸菌具有降解亚硝酸盐的酶系，但不同菌株之间对亚硝酸盐的降解能力有所差异，其中以11号菌株的降解能力最强。同时可看出，磷酸钾、磷酸钠两种缓冲体系对乳酸菌对亚硝酸盐的降解作用无明显差异。

2.3 11号菌株形态特征鉴定结果

经分离的11号菌株在MRS固体培养基中培养3d后，菌落呈乳白色，表面光滑，隆起，菌落边缘整齐，菌落直径小于或等于1mm，如图1所示。经革兰氏染色和镜检后发现菌株为革兰氏阳性菌，且不产生芽孢。

图1 11号菌株的平板菌落形态Fig.1 Strain No.11 on the plate

2.4 生理生化实验鉴定结果

所筛11号菌株在过氧化氢酶反应实验中不产气泡，为阴性反应；在醋酸铅试纸反应实验中变黑，呈阳性反应；甲基红实验时甲基红试剂由橙黄色变为红色，阳性反应。由2.3节和2.4节实验结果可以初步将所筛选的11号菌株鉴定为乳酸菌。

2.5 基因组提取检测结果

采用琼脂糖凝胶电泳检测提取11号菌株基因组DNA，其结果如图2所示，由图2可判断，采用CTAB法提取的基因组DNA效果较好，2号泳道具有明显的Smear拖尾条带，说明提取的基因组DNA比较完整，有利于16S rRNA的测序比对。

图2 11号菌株DNA基因组电泳检测结果Fig.2 Ggarose gel electrophoresis analysis of the No. 11 strain genome extracted

2.6 16S rRNA同源性分析及序列比对结果

取得11号菌株16S rRNA 序列后，从GenBank基因数据库中调取Lactobacillus fermentum PL9005的16S rRNA序列进行同源性比较，结果显示11号菌株16S rRNA 序列片段(1133bp)与Lactobacillus fermentum PL9005的同源性较高，达到98%，可初步确定11号菌株与Lactobacillus fermentum PL9005的进化关系接近，结果如图3所示。

图3 11号菌株的16S rRNA基因组序列与相关菌株基因组序列的同源性比对Fig.3 Homologous alignment of 16S rRNA sequences of strain No. 11 and related strains

2.7 系统发育进化树构建结果

将11号菌株16S rRNA全序列在NCBI网站上进行Blast比对后，选取适当数量同源性较高的不同菌株构建系统发育进化树，由图4可见，11号菌株与Lactobacillus fermentum PL900516亲缘关系最近，可初步确定11号菌株即为 Lactobacillus fermentum。

图4 系统发育进化树构建结果Fig.4 Polygenetic tree based on the complete 16S rRNA sequence of strain No. 11

3 讨 论

在发酵液中亚硝酸盐含量测定实验中，由于亚硝酸盐易吸水潮解，故在配制亚硝酸钠标准溶液时，须将其烘干。因对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺见光易发生副发应，所以两种试剂配制好后一定要避光保存，当加入上述两种试剂后溶液也应避光以免发生副反应。

所筛选的乳酸菌11号菌株的16S rRNA序列(1133bp)与Lactobacillus fermentum strain PL9005的同源性达到98%，根据序列同源性的不同，系统发育进化树的构建方法也不同。如模型合适，最大似然(ML)的效果最好，对于近缘序列，简约(MP)的效果较好，而对于同源性不很高的序列，一般用邻近(NJ)或ML。本研究所得序列在Blast上进行同源性比对后发现与其他菌种序列的同源性除个别较高之外，其余的同源性都不太高，因而在构建系统进化树时采用NJ法构建[11]。根据实验结果，可初步确定11号菌株为Lactobacillus fermentum。

利用乳酸菌进行酱腌菜的纯种和混合发酵，可减少有害菌的影响并显著降低酱腌菜中亚硝酸盐含量，既可提高蔬菜的营养保健作用，又可使蔬菜增效、增值[4-5]。本实验从三江镇腌菜中选育出高效降解亚硝酸盐的优良乳酸菌菌株，在此基础上拟将亚硝酸还原酶基因(nirS)克隆到乳酸乳球菌中进行高效诱导表达[12]，分析纯种培养在腌菜制作中降解亚硝酸盐的可行性，为其在食品中的应用奠定基础。

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Screening and Preliminary Identification of a Lactic Acid Bacterium Strain with the Capacity of Nitrite Degradation from Sanjiang Pickled Potherb Mustard

LIU Zhi-wen1，YUAN Wei-jing2，ZHANG San-yan1，LUO Jing3，CHEN Zhong-liang1，LI Kun-tai1，GUO Xiao-yan1，XU Bo1,*
(1. Nanchang Key Laboratory of Applied Fermentation Technology, College of Bioscience and Engineering, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China；2. The Lixin College of Beijing, Beijing 100037, China；3. Second Clinical Medical College of Southern Medical University, Guangzhou 510515, China)

A strain of lactic acid bacteria with strong ability to degrade nitrite was screened from pickled potherb mustard made in Sanjiang town, Jiangxi province. The strongest ability of the strain to degrade nitrite averagely reached 32.66 μg/mL during 68 h of fermentation. The results of 16S rRNA sequencing showed that this strain was 98% homologous to Lactobacillus fermentum PL9005. Polygenetic analysis indicated that this strain belonged to Lactobacillus fermentum.

lactic acid bacteria；nitrite degradation；screening；identification

Q939.97

A

1002-6630(2012)01-0166-04

2011-09-05

江西省教育厅科研基金项目(GJJ11407)；南昌市科技局科研基金项目(洪科发计字(2011)158-52)；江西省科技厅科技支撑项目(2009BNB05704)

刘志文(1967—)，女，实验师，本科，研究方向为微生物学。E-mail：zhiwenliu1967@sohu.com

*通信作者：徐波(1970—)，男，副教授，博士，研究方向为食品生物技术。E-mail：xubo583@sina.com