响应面法优化黑加仑果醋的发酵条件

牛广财，严宝冬，朱 丹，魏文毅，关 琛

(1.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江 大庆 163319；2.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，黑龙江 大庆 163319)

响应面法优化黑加仑果醋的发酵条件

牛广财1，严宝冬1，朱 丹2，魏文毅1，关 琛1

(1.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江 大庆 163319；2.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，黑龙江 大庆 163319)

采用响应面分析法(RSM)优化黑加仑果醋发酵的工艺条件。在初始酒精体积分数、pH值、装液量、摇床转速4个因素的单因素试验基础上，采用Box-Behnken试验设计，通过响应面分析，对黑加仑果醋的发酵工艺条件进行优化。结果表明：黑加仑果醋发酵的最佳工艺条件为：初始酒精体积分数5.7%、pH4.5、装液量97mL/500mL、摇床转速126r/min，在此条件下的验证实验表明，黑加仑果醋的醋酸转化率为96.78%。黑加仑发酵型果醋呈玫瑰红色，果香浓郁，酸爽柔和。

黑加仑；果醋；发酵；响应面；优化

黑加仑(Ribes nigrum L.)又名黑豆果，学名黑穗醋栗，属虎耳草科茶藨子属，是多年生小灌木，多汁浆果，味酸甜清香。黑加仑富含糖、有机酸以及VC等多种营养成分[1]。大量研究表明，黑加仑具有防癌、改善视力、控制糖尿病、改善血液循环、降血压、降血脂、改善老年人健忘、行为迟缓等多种保健功能[2-5]。

随着人们保健意识的加强，果醋的口味及营养越来越受到人们的关注。因此，本实验以黑加仑果汁为原料，利用自选醋酸菌，并采用响应面分析方法对黑加仑果醋的发酵条件进行优化，从而确定自选醋酸菌的最佳发酵工艺参数，开发出营养健康、风味独特的黑加仑果醋产品，为其工业化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌种、试剂与培养基

AS1.41醋酸杆菌，由黑龙江八一农垦大学食品学院发酵实验室保藏。

乙酸、乙醇、K2HPO4、氢氧化钠、壳聚糖等为国产分析纯。

活化培养基：麦芽糖1.15g、酵母浸粉1.03g、无水乙酸0.96mL、无水乙醇1.97mL、K2HPO40.22g、蒸馏水100mL，pH4.5。

1.2 仪器与设备

HZQ-QX全温振荡器 哈尔滨东联电子技术开发有限公司；SPH-250型生化培养箱 上海森信实验仪器有限公司；BCN-1360型超净工作台 北京东联哈尔仪器有限公司；LDZX-75KBS型立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；WS108型手持折光仪 上海测维光电技术有限责任公司。

1.3 方法

1.3.1 黑加仑果酒的制备工艺流程

黑加仑果酒→接种醋酸菌→发酵→澄清→杀菌→灌装→成品

将黑加仑果汁的糖度调整到22°Bx，以300mL/500mL的装液量装入三角瓶中，按体积分数7%的接种量将活化好的酵母菌接种到黑加仑汁里[6]，添加60mg/L的SO2，在24℃条件下发酵7d即得到黑加仑果酒，该果酒酒精体积分数为13.2%[7]。

1.3.2 操作要点

1.3.2.1 自选醋酸菌的活化

将AS1.41醋酸杆菌接入活化培养基中，在32℃、160r/min的恒温振荡培养箱中活化18h。

1.3.2.2 澄清

采用壳聚糖对黑加仑果醋进行澄清处理[8]。

1.3.3 单因素试验研究

在pH4.5、装液量100mL/500mL，接种量10%，于32℃、120r/min振荡培养10d的条件下，考察酒精体积分数：4%、5%、6%、7%、8%对黑加仑果醋发酵的影响；在酒精体积分数5%，装液量100mL/500mL，接种量10%，于32%、120r/min的振荡培养10d的条件下，考察初始pH3.5、4.0、4.5、5.0、5.5对黑加仑果醋发酵的影响；在酒精体积分数5%，初始pH4.5，接种量10%，于32℃、120r/min的振荡培养10d的条件下，考察装液量(总体积500mL)50、75、100、125、150、175mL对黑加仑果醋发酵的影响；在酒精体积分数5%，初始pH4.5，装液量100mL/500mL，接种量10%，于32℃振荡培养发酵10d的条件下，考察摇床转速60、90、120、150、180r/min对黑加仑果醋发酵的影响。每天记录其酸度变化，确定合适的发酵条件范围，以便进一步优化发酵的工艺参数。

1.3.4 响应面法对发酵工艺优化

通过单因素试验，根据Box-Benhnken中心组合试验设计原理，以醋酸转化率为响应值，设计四因素三水平响应面分析试验，因素水平编码见表1。数据用SAS 8.2程序分析确定最优发酵工艺参数[9-10]。

表 1 因素水平方案设计表Table1 Factors and levels of Box-Benhnken experiment design

1.3.5 测定指标及方法

可溶性固形物的测定：采用手持折光仪法；还原糖的测定：采用直接滴定法[11]；酒精度的测定：按GB/T 394.2—2008《酒精通用分析方法》测定；VC的测定：采用2,6-二氯靛酚法；重金属测定：采用原子吸收分光光度计法[12]。细菌总数的测定：按GB/T 4789.2—2008《食品卫生微生物学检验 菌落总数测定》规定方法；大肠菌群的测定：按GB/T 4789.3—2008《食品卫生微生物学检验 大肠菌群计数》规定方法。

产酸量测定[13]：取1mL发酵液，加入50mL蒸馏水，滴入2～4滴0.5%酚酞酒精溶液，用0.1mol/L的NaOH溶液滴定至浅粉红色。由消耗的NaOH溶液的体积计算样品中的产酸量(g/L，以醋酸计)，再进一步计算醋酸转化率。

式中：V1为滴定发酵液样品耗用的NaOH溶液的体积/mL；V0为滴定加入醋酸菌之前调好的果酒耗用的NaOH溶液的体积/mL；60.05为醋酸的摩尔质量浓度/(g/mol)；c为NaOH溶液的浓度/(mol/L)；V为样品的体积/mL。

式中：酒精的体积分数转换成酒精质量浓度(g/L)按1:8比例换算[14]。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 酒精体积分数对醋酸转化率的影响

酒精体积分数是影响醋酸发酵的首要因素[15-16]，因此，要对发酵条件进行优化，首先要考虑合适的酒精体积分数。测定在1～10d内不同酒精体积分数对醋酸转化率的影响，结果如图1所示。

图1 酒精体积分数对醋酸转化率的影响Fig.1 Effect of alcohol volume on vinegar conversion rate

由图1可知，不同酒精体积分数条件下的醋酸转化率差异很大，从每个酒精体积分数条件下的最高点来看，酒精体积分数在4%～9%之间时，转化率随着酒精体积分数的升高而呈先升高后降低趋势，当酒精体积分数4%时，发酵到第6天以后，由于发生轻微过氧化现象，转化率稍有降低。酒精体积分数在8%和9%时的醋酸转化率一直都很低，所以综合来看，最适的发酵酒精体积分数选择在5%～7%之间。

2.1.2 初始pH值对醋酸转化率的影响

醋酸菌的生长需要一定的p H值范围，不同的pH值对发酵的影响也很大，合适的底酸质量浓度对醋酸菌的生长繁殖有一定的促进作用[17]。测定1～10d内不同初始pH值对醋酸转化率的影响，结果见图2。

图2 初始pH值对醋酸转化率的影响Fig.2 Effect of the initial pH on vinegar conversion rate

由图2可知，不同pH值对醋酸转化率的影响很大，pH3.5时，由于底酸质量浓度过高抑制了醋酸菌的生长，导致在第6天以后醋酸菌不再繁殖，转化率几乎不变，而pH值为5.5时，发酵到第6天以后转化率急剧下降，出现严重的过氧化现象，因此选择初始pH值在4.0～5.0之间。

2.1.3 装液量对醋酸转化率的影响

装液量的多少直接影响到发酵液溶氧量的多少，也就直接影响到醋酸菌菌体的生长，从而对整个发酵过程产生影响。测定1～10d内不同的装液量对醋酸转化率的影响，结果见图3。

图3 装液量对醋酸转化率的影响Fig.3 Effect of loading volume on vinegar conversion rate

由图3可以看出，装液量小时，发酵速度较快，醋酸转化率高，装液量增大时，发酵速度相对较慢，当装液量为150mL/500mL和175mL/500mL时，由于装液量过大，溶氧量不足，菌体不能够得到充分的氧气进行生长代谢，进而影响发酵；而装液量为50mL/500mL时，过多的溶解氧加速了菌种的繁殖，消耗了发酵液中过多的养分，过多的氧也会抑制代谢，所以在发酵到第7天以后发生过氧化现象，因此选择装液量为75mL/500mL～125mL/500mL较适宜。

2.1.4 摇床转速对醋酸转化率的影响

摇床的转速也是直接影响发酵液中溶解氧量的直接条件，因此，测定1～10d内不同的摇床转速对醋酸转化率的影响，结果见图4。

图4 摇床转速对醋酸转化率的影响Fig.4 Effect of rotation speed on vinegar conversion rate

由图4可知，摇床转速对醋酸转化率有一定的影响，初期的转化率较低，摇床转速在60r/min时，由于溶解氧的不足使得发酵速率一直很低，发酵后期几乎没有变化，而摇床转速在150r/min时，一方面过多的溶解氧使得醋酸菌生长旺盛，耗去发酵液中大量养分，另一方面转速过大使发酵液中酒精挥发，因此发酵到后期转化率不断下降，因此，可以确定最适摇床转速在90～150r/min之间。

2.2 黑加仑果醋发酵条件的优化

2.2.1 回归方程建立与方差分析

对表2结果进行回归分析得二次回归方程(表3)为：Y＝96.75333-6.039167X1＋0.923333X2-1.384167X3＋2.036667X4-9.525417＋1.8175X2X1-3.461667-1.0875X3X1-0.18X3X2-3.72791+1.6725X4X1-0.2875X4X2+1.26X4X3-3.676667。

如表4所示，一次项、二次项、交互项、总回归模型的P＜0.01，都是极显著的；失拟项的F值较小，而P＞0.0 5，不显著；回归方程的决定系数R2=0.9805，说明回归方程的拟和效果较好，各个因素对醋酸转化率均有显著的影响。

表2 响应面分析试验设计及结果Table2 Design and test results of response surface analysis

表3 回归系数显著性检验表Table3 Significance test table of regression coefficient

为了确定最佳点的值，采用SAS软件的RSREG程序对实验模型进行分析，以得到黑加仑果醋发酵的最佳工艺条件，经典型性分析得出最佳发酵条件为：酒精体积分数5.71%、初始pH4.52、装液量97.18mL/500mL、摇床转速125.70r/min。该条件下，黑加仑果醋的理论醋酸转化率预测值为97.92%。

表4 方差分析表Table4 Variance analysis

2.2.2 验证实验

为检验实验的可靠性，采用上述最佳发酵条件进行黑加仑果醋的发酵实验，同时，考虑到实际操作的便利，将最佳条件修正为酒精体积分数5.7%、初始pH4.5、装液量97mL/500mL、摇床转速126r/min，经过5次重复实验，实际得到的黑加仑果醋醋酸转化率平均值为96.78%，与理论预测值97.92%的相对误差小于5%，说明该方程与实际情况拟合良好，响应面分析所得到的优化模型是可靠的，表明该数学模型对优化黑加仑果醋发酵工艺条件是可行的，具有实用价值。

3 产品质量指标

3.1 感官指标

黑加仑果醋颜色呈玫瑰红色，具有浓郁的黑加仑果香；产品口感浑厚，酸爽柔和；澄清透明，无悬浮物及沉淀。

3.2 理化指标

总酸(以醋酸计)：58.0g/L；可溶性固形物：7.0%；还原糖(以葡萄糖计)：2.68g/L；VC：87.0mg/100mL；铅(以Pb计)：0.16mg/L：砷(以As计)：0.0048mg/L。

3.3 微生物指标

细菌总数＜100CFU/mL；大肠菌群、致病菌：未检出。

4 结 论

黑加仑果醋最佳的醋酸发酵工艺条件为：初始酒精体积分数5.7%、pH4.5、装液量97mL/500mL、摇床转速126r/min，在该条件下，黑加仑果醋醋酸转化率为96.78%。黑加仑发酵型果醋呈玫瑰红色，营养丰富，果香浓郁，口感浑厚，酸爽柔和，具有很好的开发前景。

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Optimization of Fermentation Conditions for Black Currant Fruit Vinegar by Response Surface Methodology

NIU Guang-cai1，YAN Bao-dong1，ZHU Dan2，WEI Wen-yi1，GUAN Chen1
(1. College of Food Science, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China；2. College of Life Science and Technology, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China)

Response surface methodology was used to optimize fermentation conditions for black currant fruit vinegar. Based on the results of single factor experiments, Box-Behnken experiment design was used to analyze and optimize initial alcohol concentration, pH, ratio of medium volume to shake flask volume and rotational speed. The optimal fermentation conditions were determined as follows: initial alcohol concentration 5.7%, initial pH 4.5, ratio of medium volume to shake flask volume 97:500, and rotational speed 126 r/min. Further validation experiments showed that the conversion rate of acetic acid was 96.78% under the optimal conditions. The black currant fruit vinegar obtained showed red rose color, strong fruity aroma and pleasant soft sour taste.

black currant；fruit vinegar；fermentation；response surface methodology；optimization

TS255.47

A

1002-6630(2012)01-0157-05

2011-09-26

黑龙江省研究生创新科研基金项目(YJSCX2011-263HLJ)

牛广财(1971—)，男，教授，博士，研究方向为果蔬贮藏加工与发酵食品。E-mail：guangcainiu@yahoo.com.cn