中性植酸酶产生菌的筛选、鉴定及酶学性质

王 陶，李 文，袁佩佩

(徐州工程学院食品(生物)工程学院，江苏 徐州 221111)

中性植酸酶产生菌的筛选、鉴定及酶学性质

王 陶，李 文，袁佩佩

(徐州工程学院食品(生物)工程学院，江苏 徐州 221111)

从土壤中分离到一株高产中性植酸酶的菌株，酶活力达12.52U/mL。对其进行形态、生理、生化、分子生物学鉴定，初步鉴定为放射型根瘤杆菌(Agrobacterium radiobacter)。酶学性质研究结果表明：该酶的最适反应温度为45℃；最适反应pH值为7.0；65℃处理60min酶活力保持80%左右，有一定耐热性；在pH5.5～8.0之间，稳定性较好；Ba2+对酶活力有一定的激活作用，Fe2+、Mg2+、Zn2+和Cu2+对酶活力均有一定程度的抑制作用，其中Fe2+的抑制作用最强。

中性植酸酶；筛选；鉴定；酶学性质

植酸酶，即肌醇六磷酸磷酸水解酶，是一类特殊的正磷酸单酯磷酸水解酶，催化植酸水解生成低级肌醇磷酸衍生物和无机磷酸[1]。作为一种新型的饲用酶制剂，它可使植物性饲料中磷的利用率提高60%，粪便中磷排泄量减少40%[2]，而且能够通过降低植酸盐的抗营养作用，增加动物对蛋白质和一些金属离子的吸收能力[3]。目前，植酸酶已经开始试用在植物性食品中，达到分解植酸磷，平衡营养的作用[4]。植酸酶普遍存在于植物、真菌、酵母和细菌中，其中微生物植酸酶因活性高、生产比较容易等诸多优点，对其研究和开发最为广泛和深入[5]。

不同来源的植酸酶多种多样，根据最适pH值的不同，植酸酶可分为酸性植酸酶、中性植酸酶和碱性植酸酶[6]，中性植酸酶主要应用于消化道无胃、肠道呈中性的淡水鲤科鱼类饲料[7]，对提高鱼类的生长效益、品质及降低饲料中植酸磷对环境的污染有重要意义，近几年在水产上受到重视[8]。此外，中性植酸酶还可在pH值逐渐升高至中性的单胃畜禽动物肠道中起作用，延长植酸酶在整个动物胃肠道中的作用时间，提高其有效性。目前已分离出多种产中性植酸酶的芽孢杆菌(Bacillus)，主要是枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、淀粉液化芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)及其他菌株(Bacillus sp.)等[9]。本研究拟从自然界的土壤中筛选出新的产中性植酸酶的菌株，并研究其酶学性质，以期进一步开发产中性植酸酶的微生物资源，为其应用打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

土样：采自徐州工程学院附近的农场、树林、果园等处。

1.2 培养基

平板分离培养基(g/L)：葡萄糖15、植酸钙5.0、(NH4)2SO43、K2HPO41、MgSO4·7H2O 0.5、KCl 0.5、FeSO4·7H2O 0.1、MnSO4·7H2O 0.1、琼脂20，pH7.0；斜面培养基(g/L)：NaNO32、K2HPO41、MgSO4·7H2O 0.5、KCl 0.5、FeSO40.01、蔗糖30、琼脂20，pH7.0；摇瓶产酶培养基(g/L)：葡萄糖15、蛋白胨3、(NH4)2SO42、MgSO4·7H2O 2、KCl 0.5、FeSO40.03、MnSO4·7H2O 0.03，pH7.0。

1.3 菌株的筛选

1.3.1 中性植酸酶产生菌的初筛

称5.0g土样于含数粒玻璃珠的45mL无菌生理盐水中，100r/min摇床上振荡30min后静置30min，取上清液原液以及10-1、10-2的稀释液涂布初筛平板，于(29±1)℃条件下培养3～5d，挑取透明圈直径与菌落直径比大的菌落于斜面(29±1)℃培养3～5d。

1.3.2 中性植酸酶产生菌的复筛

菌株接种于锥形瓶中，在(29±1)℃、150r/min培养96h，以4000r/min的速度将发酵液离心10min，上清液为粗酶液，测定粗酶液中植酸酶的活力。

1.4 中性植酸酶活力测定

参照文献[10]的方法进行。

酶活力单位定义：在温度37℃、pH7.0条件下，每分钟从浓度为5.0mmol/L植酸钠溶液中释放lμmol无机磷所需的酶量即为一个植酸酶活力单位，以U表示。

1.5 菌种遗传稳定性检测

将高产植酸酶菌株连续传6代，分别摇瓶发酵测酶活力，检测菌株的遗传稳定性。

1.6 菌种的初步鉴定

1.6.1 菌株形态学观察[11]

观察菌落形态，并于光学显微镜下观察菌体革兰氏染色、芽孢及鞭毛染色结果。

1.6.2 菌株的生理生化特性鉴定

参照文献[12-13]的方法进行。

1.6.3 菌株分子生物学鉴定

提取菌株的基因组DNA[14]，根据细菌16S rDNA序列保守性设计通用引物[15]：上游引物5＇-AGAGTTTG ATCCTGGCTCAG-3＇，下游引物：5＇-GGTTACCTTG TTACGACTT-3＇，进行PCR扩增，PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，将测定的序列提交Gene Bank数据库，使用Blast程序与数据库中已有的16S rDNA序列进行相似性比较分析，从GeneBank中选择近缘菌株的16S rDNA序列，应用邻接法构建系统发育树，分析该菌株的系统分类地位。

1.7 中性植酸酶粗酶液的酶学性质

1.7.1 酶反应的最适温度

将粗酶液分别在不同温度(15、25、35、45、55、60、65、70℃)条件下进行酶促反应，测定酶活力，确定最适温度。

以最高酶活力为100%，在其他条件下的酶活力占最高酶活力的百分数即为该酶在此条件下的相对酶活力。

1.7.2 酶的热稳定性

在不同温度(3 5、45、55、65、70℃)条件下处理粗酶液30min和60min，再在37℃条件下测定酶活力。

1.7.3 酶反应的最适pH值

配制pH值为2.0～7.0的HAc-NaAc缓冲液、pH值为7.5～9.0的Tris-HCl 缓冲液，在上述不同的pH值条件下测定粗酶液的酶活力，确定最适pH值。

1.7.4 酶的pH值稳定性

用不同pH值(2.0、3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)的缓冲液在37℃条件下处理酶液30min和60min，然后调回最适pH值，测定剩余的酶活力。

1.7.5 金属离子和螯合剂对酶活力的影响

在缓冲液中分别添加质量浓度为0.1g/100mL的CaCl2、MgSO4、ZnSO4、CuSO4、FeSO4、NaCl、KCl、Ba(OH)2、EDTA-Na2，在温度37℃、pH7.0条件下测定酶活力。

2 结果与分析

2.1 中性植酸酶产生菌的筛选结果

图1 中性植酸酶产生菌的透明圈Fig.1 Transparent circles of primarily screened strains

在分离的30株菌中筛选出8株菌产中性植酸酶，其中真菌6株，细菌2株。初筛产透明圈情况见图1。从中选取透明圈直径与菌落直径比值较大的菌株，进行液体发酵，在中性条件下测定粗酶液的酶活力，结果见表1。编号为4的菌株酶活力最高，为12.52U/mL。

表1 各菌株的植酸酶活力Table1 Neutral phytase activity of primarily screened strains

2.2 菌株的遗传稳定性

对筛选得到的菌株4进行6次传代，分别测其酶活力，结果如表2，可以看出，该菌株有较好的遗传稳定性。

表2 菌株的遗传稳定性Table2 Genetic stability of strain IV

2.3 中性植酸酶产生菌的鉴定

2.3.1 形态特征

菌株4的菌落呈圆形、边缘整齐、中间隆起、厚实、半透明状、较为湿润，经显微镜下观察，该菌为革兰氏阴性杆菌，有鞭毛无芽孢。

2.3.2 生理生化特征

表3 菌株4生理生化测定结果Table3 Physiological and biochemical properties of strain IV

从表3可以看出，该菌株最适生长温度为30℃，最适生长pH值为7.3，该菌株生长无需NaCl，但在1g/100mL的NaCl中生长最好，且可耐受3g/100mL的NaCl。H2S产生实验、V-P实验、过氧化氢酶实验阳性，甲基红实验、乙醇氧化成乙酸实验、淀粉水解实验阴性。能利用蔗糖、葡萄糖、阿拉伯糖、硝酸钠、磷酸氢二铵。

2.3.3 分子生物学鉴定

图2 以菌株4的16S rRNA序列为基础的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree based on the 16S rRNA sequence of strain IV

经测序获得菌株的16S rDNA序列，长度为1347bp，见图2。将此序列提交到GeneBank数据库(登录号为S000001393)，进行序列比对分析，从数据库中选择近缘菌株的16S rRNA基因序列，应用邻接法构建系统发育树如图2所示，进化树表明菌株4与放射型根瘤杆菌(Agrobacterium radiobacter)亲缘关系最近，且在一个分支中。综合形态特征、生理生化实验结果以及序列比对结果，确定该菌株为Agrobacterium radiobacter。

2.4 中性植酸酶的酶学性质

2.4.1 酶反应的最适温度

图3 温度对酶活力的影响Fig.3 Effect of temperature on the activity of neutral phytase

如图3所示，随着温度的增加，酶活力呈缓慢上升趋势，到达45℃时酶活力最高，温度超过55℃之后酶活力开始迅速下降。可见，酶反应的最适温度为45℃。

2.4.2 酶的热稳定性

图4 酶的热稳定性Fig.4 Thermal stability of neutral phytase

由图4可知，中性植酸酶粗酶液具有一定的耐热性，在45℃处理30min和60min，相对酶活力保持在100%；在55、65℃处理30min和60min，相对酶活力都能保持在80%左右，延长处理时间对酶活力的影响不大，70℃处理后，酶活力损失90%以上。

2.4.3 酶反应的最适pH值

图5 pH值对酶活力的影响Fig.5 Effect of pH on the activity of neutral phytase

由图5可知，酶反应的最适pH值为7.0，且在pH值为6.0～8.0范围内，相对酶活力都保持在80%以上，此酶活性较高的pH值范围恰好处在鲤科鱼类肠道的pH6.5～8.5范围内。

2.4.4 酶的pH值稳定性

图6 酶的pH值稳定性Fig.6 pH stability of neutral phytase

由图6可知，中性植酸酶在pH5.5～8.0之间，稳定性最好，相对酶活力大于80%，pH值小于3.0和pH值大于8.5时酶活力损失90%以上，随着时间的延长，酶的pH值稳定性受影响不大。

2.4.5 金属离子和螯合剂对酶活力的影响

图7 金属离子和螯合剂对酶活力的影响Fig.7 Effects of metal ions and chelating agents on the activity of neutral phytase

由图7可知，Ba2+对酶活力有一定的激活作用，它可能是该酶的激活剂，Fe2+对酶活力有很大的抑制作用，Mg2+、Zn2+和Cu2+对酶活力均具有一定的抑制作用，它们可能是酶的抑制剂，其他离子及EDTA-Na2对酶活力的影响不是很大。

3 结 论

筛选得到一株产中性植酸酶酶活较高的菌株，经形态特征、生理生化特征鉴定及分子生物学鉴定，初步判断该菌为Agrobacterium radiobacter，目前尚未见Agrobacterium radiobacter产中性植酸酶的报道，且此天然菌株的酶活力水平较高，为12.52U/mL。对此菌株产中性植酸酶粗酶液的酶学性质研究表明：该酶的最适反应温度为45℃；最适反应pH值为7.0；具有一定的耐热性，65℃处理30min和60min仍然有80%左右的相对酶活力；在pH5.5～8.0之间，稳定性较好；Ba2+对酶活力有一定的激活作用，Fe2+离子对酶活力有很大的抑制作用，Mg2+、Zn2+和Cu2+对酶活力具有轻微的抑制作用。

目前对植酸酶的研究主要集中在酸性植酸酶上，对中性植酸酶还缺乏系统的研究。本研究获得产中性植酸酶的新菌株，酶活力水平较高，且有一定的耐热性，具有潜在的开发利用价值。下一步的工作可从菌株本身和发酵条件两方面进行改良，进一步提高其酶活力，增大其应用潜力。

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Screening and Identification of a High-Yield Neutral Phytase-Producing Strain and Characterization of Neutral Phytase

WANG Tao，LI Wen，YUAN Pei-pei
(College of Food (Biological) Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221111, China)

A high-yield neutral phytase-producing strain with an enzymatic activity of 12.52 U/mL was isolated from soil and initially identified as Agrobacterium radiobacter based on its morphological, physiological and biochemical characteristics as and 16S rDNA sequence. The optimum reaction temperature and pH of neutral phytase produced by the strain were 45 ℃ and 7.0, respectively. The relative activity of the enzyme was 80% after heating at 65 ℃ for 60 min, revealing that it was thermostable to some extent. The enzyme was stable at pH values in the range of 5.5-8.0. Its activity could be activated by Ba2+but inhibited by Fe2+, Mg2+, Zn2+and Cu2+.

neutral phytase；screening；identification；enzymatic properties

S816.7；Q933

A

1002-6630(2012)01-0120-05

2011-02-17

江苏省高校自然科学基础研究面上项目(10KJD180006)；徐州工程学院科研基金青年课题(XKY2009122)；徐州工程学院科研基金培育课题(XKY2010112)；徐州工程学院大学生创新创业基金项目(201112)

王陶(1976—)，男，副教授，博士，研究方向为离子束生物工程和资源微生物学。E-mail：wangtaohf@126.com