氟比洛芬酯预先给药对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的影响

李永刚 米乐 王民 张英

缺血再灌注损伤是一系列因素综合作用所引起的病理和生理反应。缺血可严重损伤组织细胞，组织再灌注会产生大量的氧自由基，这些氧自由基可进一步加重细胞的损伤。氟比洛芬酯是一种非选择性的环氧合酶抑制剂，通过抑制前列腺素的合成起到抗炎、镇痛作用。有研究报道，氟比洛芬酯静脉预先给药可以减轻大鼠的脑缺血再灌注损伤［1－3］，本研究在此基础上探讨氟比洛芬酯预先给药对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的影响，并探讨其对肝脏的保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物选择、分组与给药方法 雄性健康SD大鼠48只，体重250～300 g，鼠龄6～8周。由河北医科大学实验动物中心提供。随机分为假手术组(S组)、缺血再灌注组(I/R组)和氟比洛芬酯预先给药组(FB组)，每组16只。大鼠肝脏缺血再灌注模型的制备参照Nauta法建立大鼠肝脏部分缺血再灌注损伤模型，术前实验动物禁食12 h，自由进水，乙醚吸入麻醉，上腹部正中切口，切开腹壁各层，显露第一肝门部，暴露肝脏左、中叶之肝蒂，离断肝至横膈及腹壁的韧带，用无损伤血管夹将供应肝左叶、中叶血的门静脉和肝动脉分枝阻断60 min，使约70%的肝脏缺血，以防止发生严重肠系膜静脉瘀血，然后取下血管夹恢复肝脏血供6 h。S组只行开腹及暴露左、中肝叶肝蒂，不阻断肝叶供血;I/R组参照Nauta法建立肝脏部分再灌注损伤模型，缺血前15 min自尾静脉注射等容量的0.9%氯化钠溶液，左、中肝叶缺血60 min，再灌注6 h;B组缺血前15 min自尾静脉注射氟比洛芬酯10 mg/kg，左、中肝叶缺血60 min，再灌注6 h;于再灌注6 h时切取肝脏组织。(1)从大鼠的腹主动脉采集血液2 ml，提取血液标本，提取后的血清放在冰箱－80℃保存，待测。(2)处理肝组织:切取约为1 mm3的肝脏组织，马上放入2.5%戊二醛中固定，固定的肝组织用于电镜观查;用4%的多聚甲醛固定适量的肝组织，固定后通过脱水、透明和浸蜡等过程做成石蜡包块，待测;一部分肝组织标本按重量加入0.9%氯化钠溶液做成10%的肝组织匀浆，用以检测丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的含量。

1.2 主要药物、试剂与仪器 氟比洛芬酯(50 mg/5 ml，北京泰德制药有限公司);SOD试剂盒(A-001，建成生物工程公司，南京);MDA试剂盒(A-003，建成生物工程公司，南京);TNF-α试剂盒(博士德生物工程研究所，武汉);NF-κB免疫组化试剂盒(Santa Cruz公司，美国);Selectra-E自动生化分析仪(姗顿公司，英国);Citadel-2002脱水器(Vita，荷兰);Histocentrez包埋仪(Vita，荷兰);AS425切片机(姗顿公司，英国);YT8B烤片机(孝亚光电子技术公司，湖北);YNY781B微波仪(临安电子器材研究所，浙江);BHS显微镜(姗顿公司，英国);眼科无损伤镊，眼科持针器，血管钳，眼科无损伤动脉夹等均购自天津医疗器械厂。血清的丙氨酸氨基转移酶(ALT)含量和透明质酸(HA)含量分别采用Selectra-E自动生化分析仪(姗顿公司，英国)和放射免疫法监测。肝组织的MDA含量和SOD活性分别由硫代巴比妥酸(TBA)和黄嘌呤氧化酶法测定。肝脏标本的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达和核因子-κB(NF-κB)的表达分别由免疫酶联吸附试验法(ELISA)和免疫组化法检测。在电镜下观察由伊红(HE)染色的肝组织的形态学改变。

1.3 统计学分析应用SPSS 13.0统计软件，计量资料以表示，计量资料先行正态性检验，再行方差齐性检验，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组观察指标比较 与S组比较，I/R组肝组织的ALT、HA及 TNF-α 水平、MDA 含量、NF-κB 表达升高(P＜0.05)，SOD活性下降(P＜0.05);与 I/R组比较，FB组 ALT、HA及TNF-α 水平、MDA 含量、NF-κB 表达降低(P＜0.05)，SOD 活性增高(P＜0.05)。见表1。

2.2 电镜下情况 可见肝脏组织中的线粒体肿胀，并逐渐加重，数量减少(由45% ～55%缩减到5% ～12%)，嵴变短，粗面内质网的扩张逐渐严重，有明显的脱颗粒现象。FB组损伤程度轻于I/R组。

表1 3组观察指标比较n=16，±s

表1 3组观察指标比较n=16，±s

注:与 S组比较，*P ＜0.05;与 I/R 组比较，#P ＜0.05

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3 讨论

本研究参照文献［3，4］，制备大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型，结果表明，与S组相比，再灌注6 h后，I/R组肝脏AST、HA水平升高，SOD活性降低，提示模型制备成功。

氟比洛芬酯是一种非选择性的环氧合酶抑制剂，药理作用是通过羧基酯酶水解生成氟比洛芬。通过抑制前列腺素的合成起到抗炎，镇痛作用。氟比洛芬酯减轻缺血再灌注损伤呈剂量依赖性，10 mg/kg的效果最好，注射氟比洛芬酯15 min后，抗炎镇痛效应达最高水平，故本研究中选用此剂量在缺血前15 min给药［5］。

ALT含量和HA的含量是当前临床上评估肝脏功能的主要指标，也是敏感指标，当肝功能受到损伤时这两个指标会明显升高。再灌注的时候产生大量促炎因子及氧自由基，激活NF-κB，进而进一步诱导促炎因子的产生，如 TNF-α。TNF-α 的受体主要集中在肝脏，所以说肝脏是TNF-α作用的最主要的靶器官。缺血再灌注可引起TNF-α的过度表达，TNF-α的过度表达将导致大量的肝细胞发生炎性坏死。人体最主要的氧自由基清除剂是SOD，其作用是使细胞免受氧自由基的损伤，所以SOD活力的高低可以间接反映出机体抗氧自由基损伤的能力。MDA含量的多少可以反映机体脂质过氧化反应的程度，也可以间接的反映机体生成了多少的氧自由基，从而可以推测这些氧自由基机对机体细胞攻击的严重程度。

本结果表明FB组的ALT、HA和 TNF-α水平、光镜下组织形态学变化均优于I/R组。本研究还发现肝脏组织的MDA含量升高，说明在肝脏的缺血再灌注损害过程中发生了脂质过氧化反应。2组比较，FB组SOD活性高于I/R组，MDA、NF-κB含量低于I/R组其机制可能氟比洛芬酯抗炎症作用有关。

综上所述，氟比洛芬酯预先给药可以降低大鼠肝脏的缺血再灌注损伤，其机制可能与氟比洛芬酯的抗炎作用有关。

1 孙宝柱，张岫，陈琳，等.氟比洛芬酯后处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注时神经元凋亡的影响.中华麻醉学杂志，2011，31:995-997.

2 吴会生，郭培培，张宗泽，等.氟比洛芬酯预先给药对全脑缺血再灌注大鼠血脑屏障通透性的影响.中华麻醉学杂志，2010，30:1384-1387.

3 Kamada N，Calne RY.Orthotopic liver transplantation in the rat.Technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage.Transplantation，1979，47:428-431.

4 Kamada N，Calne RY.A surgical experience with five hundred and thirty liver transplants in the rat.Surgery，1983，93:64-69.

5 Wang C，Liu JL，Sang HF，et al.Therapeutic time window of flurbiprofen axetil’s effect in rat model of transient focal cerebral ischemia.Chin Med J，2008，121:2572-2577.