小檗碱对人肝癌细胞系SMMC-7721细胞增殖和凋亡的影响

黄勤杰 施超 朱健

小檗碱是从我国传统中药黄连、黄柏中提取的一种生物碱，研究表明小檗碱有抑制多种恶性肿瘤细胞系增殖和迁移的作用［1－3］。本研究通过小檗碱作用于人肝癌细胞系 SMMC-7721细胞株，探讨其对SMMC-7721细胞增殖和凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 试验药物 盐酸小檗碱购于中国药品生物制品检定所。溶于120 mmol/L的 HEPES调节液(pH值7.4)中，配制成100 μg/ml的储备液，超滤除菌，－20℃保存。

1.2 细胞培养及分组 人肝癌细胞系SMMC-7721细胞株由南京医科大学第二附属医院肿瘤科陆彬彬馈赠，在含有10%小牛血清的RPMI-1640培养液中，于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下常规培养，传代保存。对照组为加入RPMI 1640培养液的SMMC-7721 细胞，实验组为分别加入 10、20、40、60 μg/ml的小檗碱的SMMC-7721细胞。

1.3 MTT法 取对数生长期各组细胞接种于96孔板，每孔1 ×103个细胞，取 6 个复孔，实验组分为 10、20、40、60 μg/ml 4个浓度，分别培养 0、24、48、72 h 后加 MTT(5 mg/ml)20 μl/孔，37℃，5%CO2。孵箱中继续孵育 4 h，弃上清，加 DMSO 150 μl/孔，振荡20 min，使结晶充分溶解，在490 nm波长的酶联仪上检测各组的A值，绘制细胞生长曲线。

1.4 流式细胞分析 2组的MMC-7721细胞各培养48 h，经胰酶消化，制成单细胞悬液，PBS洗1次，70%冷乙醇固定，DAPI染色，上样于流式细胞仪进行细胞周期分析。

1.5 软琼脂克隆形成试验 2组的MMC-7721细胞各培养24 h，将1.2%的低熔点琼脂糖与2×1640等体积混合，取1 ml铺于24孔板，室温下使其凝固待用。将0.7的低熔点琼脂糖与含5组SMMC-7721细胞的2×1640等体积混合，取1 ml铺于顶层，每组做6个复孔，每孔含500个细胞。待顶层琼脂凝固后，置37℃、5%CO2孵箱中培养2周，观察5组细胞克隆形成情况。

1.6 统计学分析应用SPSS 11.5统计软件，计量资料以表示，采用方差分析对各组细胞周期和软琼脂克隆形成率进行分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT法 4组细胞的生长曲线，可见小檗碱对人肝癌细胞株SMMC-7721细胞增殖的抑制作用随时间延长和剂量增加而增加。见图1。

图1 4组细胞的生长曲线

2.2 流式细胞分析检测细胞凋亡 在对照组和小檗碱:0 μg/ml组中未检测到明显亚二倍体峰，小檗碱10～60 μg/ml组均检测到典型的亚二倍体峰，随小檗碱剂量增加，亚二倍体峰面积明显增加，细胞凋亡率增加。见表1、图2。

表1 流式细胞仪检测各组细胞凋亡率%，±s

表1 流式细胞仪检测各组细胞凋亡率%，±s

注:与小檗碱 0 μg/ml比较，*P ＜0.01

?

图2 流式细胞仪检测5组细胞凋亡率

2.3 软琼脂克隆形成试验 低倍镜下计数30个细胞以上的克隆:盐酸小檗碱各浓度组与实验对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。说明小檗碱对SMMC-7721细胞的克隆形成能力随药物浓度增加而增加。见表2。

表2 5组细胞软琼脂克隆形成试验n=6，%，±s

表2 5组细胞软琼脂克隆形成试验n=6，%，±s

注:与对照组比较，*P ＜0.01

?

3 讨论

肝癌是目前我国发病率和病死率均居前列的恶性肿瘤，虽然目前手术及介入已经提高了肝癌的生存时间，但晚期肝癌目前治疗效果比较差，需要我们寻找新的治疗方法。

中药是我国的传统瑰宝，在其中有许多对恶性肿瘤有效的药物，而且目前研究天然植物抗肿瘤药物成为当今国际医药界的重点方向［4，5］。

小檗碱是从我国传统中药黄连、黄柏中提取的一种生物碱，研究表明小檗碱可以诱导胃癌细胞的凋亡［6］，同时小檗碱也可以抑制乳腺癌细胞系 MCF-7和MDA-MB-231的生长［7］。有研究显示小檗碱抑制恶性肿瘤的增殖与Wnt/β-catenin信号通路相关［8］。

本研究结果表明小檗碱对人肝癌细胞株SMMC-7721细胞增殖有抑制作用，该作用随小檗碱的浓度和作用时间的增加而增加，同时小檗碱也有促人肝癌细胞株SMMC-7721细胞凋亡的作用，并随小檗碱的浓度增加而增加。同时随着小檗碱的浓度的增加，人肝癌细胞株SMMC-7721细胞克隆形成能力也出现下降。

综上所述，盐酸小檗碱可以抑制人肝癌细胞株SMMC-7721细胞的增殖并诱导其细胞凋亡，这提示小檗碱可能成为一种新的抗肝癌药物。

1 Colombo ML，Bugatti C，Mossa A，et al.Cytotoxicity evaluation of natureal cop tisine and synthesis of cop tisine from Berberine.Farmaco，2001，56:403-409.

2 Orfila L，Rodriguez M，Colman T，et al.Structuralmodification of berberine alkaloids in relation to cytotoxic activity in vitro.J Ethnopharmacol，2000，71:449-456.

3 Iizuka N，Miyamoto K，Okita K，et al.Inhibitory effect of cop tidis rhizoma and berberine on the proliferation of human esophageal cancer cell lines.CancerLett，2000，148:19-25.

4 Kizaki H，Onishi Y.TopoisomeraseⅡ Inhibitor Induced apoptosis in thymocytes and lymphoma cells.Adv Enzyme Regul，1997，37:403-423.

5 Lee KH.Anticancer drug design based on plant derived natural products.J Biomed Sci，1999，6:236-250.

6 李国英，杨林西，王玉平，等.小檗碱对人胃癌细胞株BGC2823诱导凋亡的研究.中药药理与临床，2005，21:16-18.

7 Kim JB，Lee KM，Ko EY，et al.Berberine inhibits growth of the breast cancer cell lines MCF-7 and MDA-MB-231.Planta Med，2008，74:39-42.

8 何百成，康全，杨俊卿，等.小檗碱抗肿瘤作用与Wnt/β2catenin信号转导关系.中国药理学通报，2005，21:1108-1111.