硼替佐米对小鼠急性出血坏死性胰腺炎肺损伤的治疗作用

姜仁鸦，詹银楚，吴善水，余耀生，姚宏宇，胡雅国

硼替佐米对小鼠急性出血坏死性胰腺炎肺损伤的治疗作用

姜仁鸦，詹银楚，吴善水，余耀生，姚宏宇，胡雅国

目的：观察硼替佐米对小鼠急性出血坏死性胰腺炎肺损伤的治疗作用。方法：连续7次腹内注射雨蛙素（每次间隔1 h）及脂多糖，制作小鼠重症急性胰腺炎(SAP)模型；将30只ICR雌性小鼠随机分为治疗组（注射脂多糖前0.5 h腹内注射0.5mg/kg硼替佐米）、模型组（注射脂多糖前0.5 h腹内注射50%DMSO）、空白组。最后一次注射雨蛙素2 h后麻醉小鼠，自右颈静脉取血检测血淀粉酶、LDH、CRP；光镜下观察小鼠胰腺和肺脏的病理形态，测定肺组织中MPO水平，实时荧光定量PCR测定肺组织中黏附分子ICAM-1、E-selectin、P-selectin的含量。结果：与模型组相比，治疗组小鼠血淀粉酶、LDH、CRP明显下降(P＜0.05)；治疗组小鼠胰腺和肺脏炎细胞浸润及出血明显减少(P＜0.05)，肺组织MPO和黏附分子的含量明显下降（P＜0.05）。结论：硼替佐米通过抑制黏附分子表达，减少中性粒细胞浸润，对小鼠胰腺炎肺损伤有一定的治疗作用。

急性出血坏死性胰腺炎；肺损伤；ICAM-1；选择素；硼替佐米

急性胰腺炎肺损伤（acute pancreatitis associated lung injury，APALI）是急性出血坏死性胰腺炎（acute hemorrhagic necotizing pancreatitis,AHNP）早期最常见、最严重的并发症，75%的患者早期即可出现，临床上表现为急性呼吸窘迫综合征，在这个阶段，病死率高达30%-50%[1]。硼替佐米（PS-341）是目前唯一一个批准进入临床的蛋白酶体抑制剂，它能够特异性抑制26S蛋白酶体活性，使I-κBα的降解减少，从而间接抑制了NF-κB活化，使多种炎症介质、细胞因子及黏附分子的表达和释放降低，从而减轻SAP和胰腺炎肺损伤。本实验通过建立小鼠SAP模型，研究PS-341对小鼠APALI的治疗作用及其作用机制。

1 材料和方法

1.1 动物 ICR雌性小鼠30只（由浙江大学医学院动物中心提供，SYXK(浙)2005-0072），体质量19～21 g。合适的室温（21～25℃）和湿度条件下，12 h光照/12 h黑暗交替喂养，实验前禁食12 h不禁水。

1.2 主要试剂 PS-341纯粉受赠于加拿大蒙特利尔大学吴江平教授，雨蛙素、脂多糖购自美国Sigma公司，髓过氧化物酶（MPO）测试盒购自南京建成生物公司，Real-time PCR试剂盒购自TaKaRa生物公司（日本），黏附分子引物由上海英骏生物工程有限公司合成。

1.3 分组 将30只小鼠用完全随机方法分成治疗组、模型组、空白组，每组10只。

1.4 造模方法 通过连续7次腹腔注射50μg/kg雨蛙素，每次间隔1 h，并在首次注射雨蛙素5 h后腹腔注射10 mg/kg脂多糖。治疗组：注射脂多糖前0.5 h腹腔注射硼替佐米(0.5 mg/kg)0.2 mL（硼替佐米溶解于50%DMSO，0.9%的生理盐水稀释）；模型组（DMSO组）：注射脂多糖前0.5 h腹腔注射50% DMSO 0.2 mL(生理盐水稀释)；空白组（NS组）：用生理盐水代替雨蛙素和脂多糖，依照同样的方法腹腔注射。

1.5 血清和组织标本采集方法 首次注射雨蛙素8 h后，将小鼠用50mg/kg的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，右颈内静脉取血，离心得到血清，保存于-20℃冰箱中。取血结束，剖开胸腔和腹腔，将小鼠肺、胰腺快速取出，一部分用10%的中性福尔马林固定，另一部分放冻存管中液氮速冻，而后转移到-80℃冰箱中。

1.6 检测方法及指标 血清淀粉酶、CRP和LDH检测：血清解冻后，用生理盐水稀释5倍，采用全自动生化分析仪（Olympus AU5400,日本）检测。

胰腺及肺组织病理组织学检查：10%甲醛固定，HE染色，光镜下观察病理形态。请两位病理教研室老师对胰腺和肺组织的水肿、炎性浸润、出血和坏死情况评估，评估前对实验设计均未知。评分标准按照Schmidt等制定的胰、肺病理评分系统，见表1、表2。

表1 胰腺病理学评分

表2 肺脏病理学评分

肺组织髓过氧化物酶（MPO）测定：按说明书进行测定并计算结果。

实时荧光定量PCR（Real-time PCR）检测肺脏组织中ICAM-1、P-selectin、E-selectin表达：肺组织称重后放入研钵，加入液氮研磨至粉状，立即加入1 mL TRIzol混匀，室温放置5 min；加氯仿1/5体积（0.2mL），混匀室温放置10min；4℃12 000转高速离心15 min，转上层水相到1.5 mL EP管中，加入等体积异丙醇，混匀放置10 min；4℃，12 000转高速离心10 min，弃上清，加冰预冷的75%乙醇（DEPC水溶解）1mL，4℃7500转离心5min，弃上清，空气干燥5～10 min，溶于DEPC水中至20 uL，-80℃保存肺组织总RNA。再通过逆转录酶生成cDNA，cDNA1 uL+up-primer 1 uL+down-primer 1 uL+ddH2O 7 uL+supermix 10 uL，总共20 uL加入毛细管中，离心后植入PCR仪中，采用SYBR GreenⅠ嵌合荧光法进行检测，在Roche LightCycler Real-Time PCR扩增仪上完成。引物设计见表3。组织ICAM-1，E-selectin,F-selectin表达量同GAPDH比较，计算公式为

表3 引物设计

2 结果

2.1 血生化检测 与模型组相比，治疗组血淀粉酶、LDH、CRP均明显降低，（P＜0.05），见表4。

2.2 光镜下各组胰腺及肺脏组织病理表现 组织病理学显示，与模型组相比，治疗组胰腺和肺脏出血、坏死、炎性细胞浸润均减少（P＜0.05，P＜0.01），见图1、图2，表5、表6。

表4 血淀粉酶、LDH、CRP比较

图1 胰腺组织病理形态学比较（HE×400）

图2 肺脏病理形态学观察（HE×400）

表5 各组胰腺组织病理学评分

表6 各组肺脏组织病理学评分

2.3 肺脏MPO的比较 与模型组相比，治疗组的MPO的水平明显降低，两者之间有统计学意义。见图3。

图3 肺脏髓过氧化物酶水平比较

2.4 肺脏中黏附分子的比较 与模型组相比，治疗组的黏附分子ICAM-1、P-selectin、E-selectin表达明显下降，见表7。

表7 肺脏中黏附分子的比较(u/m L，±s)

表7 肺脏中黏附分子的比较(u/m L，±s)

注：与空白组相比，aP＜0.01；与模型组相比，bP＜0.05，bbP＜0.01

组别治疗组模型组空白组n 10 10 10 ICAM-1 2.12±0.89b3.68±0.88a1.12±0.57 E-selectin 9.46±2.32a、bb16.2 ±3.86a3.12±1.32 P-selectin 25.8 ±5.67a、b32.3 ±8.72a8.15±4.71

3 讨论

AHNP是临床常见的危重病，其发病急，进展快，患者早期即可出现全身炎症反应综合征（systemic imflammation reaction syndrome,SIRS），导致远离脏器损伤和多脏器功能不全(mulple organ dysfunction syndrome,MODS)。MODS最常累及的脏器是肺,APALI的发病机制尚未完全阐明。有研究表明，中性粒细胞在肺组织中的浸润对APALI起了关键性的作用，中性粒细胞的缺失可以减轻由胰腺炎引起的肺功能障碍[1]。本实验中发现，当诱导出急性胰腺炎肺损伤模型后，肺脏中MPO活性明显升高，说明在急性出血坏死性胰腺炎的情况下，肺脏中有大量的中性粒细胞浸润。肺脏的病理改变在胰腺炎发作后数小时即可出现，主要表现为肺组织水肿、充血，导致肺组织的顺应性下降。当SAP进一步发展时，白细胞进入肺间质，增加内皮细胞的通透性导致组织水肿。在实验性胰腺炎中，用抗中性粒细胞血浆减少循环中的中性粒细胞，可以减轻远离脏器的损伤，治疗AHNP肺损伤的有效方法就是抑制中性粒细胞的黏附、聚集和活化[2]。本实验中，用PS-341治疗的小鼠肺脏病理改变明显减轻；与模型对照组相比，PS-341治疗组小鼠肺脏MPO水平明显下降，两者之间有统计学意义。以上结果证实了减少中性粒细胞在肺脏中的浸润可以减轻SAP肺损伤。

黏附分子ICAM-1、E-selectin、P-selectin是表达在内皮细胞表面的一种糖蛋白，在急性炎症反应中，内皮细胞通过细胞因子、趋化因子和表达黏附分子对炎症刺激产生反应。E-selectin、P-selectin减慢循环中中性粒细胞移动的速度，以便它们能检测到内皮细胞表面的趋化因子和黏附分子[3]。激活的中性粒细胞黏附到内皮细胞表面，是由于中性粒细胞表面的受体蛋白（CD11/CD18）和内皮细胞表面的黏附分子（如ICAM-1）相互作用的结果[4]。在急性胰腺炎动物模型中，人们用单克隆抗体或抗细胞因子的药物减少黏附分子的表达，从而减轻肺损伤[5]。PS-341是一种强效、高度选择性的proteasome抑制剂，PS-341抑制了I-kB的降解，使NF-kB活性受到抑制。NF-kB活性受抑制后，各种黏附分子ICAM-1，E-selectin、P-selectin的产生大为减少，从而减少中性粒细胞在肺脏中的浸润，减轻肺损伤的程度。本实验中，模型对照组肺脏的ICAM-1，E-selectin、P-selectin水平明显高于PS-341治疗组，说明AHNP小鼠并发肺损伤时肺脏组织中黏附分子的产生明显增多，而PS-341治疗后黏附分子的产生明显减少，这一点与肺脏病理改变的严重程度及肺脏MPO水平的高低相一致。以上结果证实了下调黏附分子的表达可以减轻胰腺炎肺损伤。

PS-341通过抑制黏附分子的表达，减少中性粒细胞在肺脏中的浸润，从而减轻胰腺炎肺损伤。目前已知，抗氧化剂对NF-kB的活化也有抑制作用，但Steinle等[6]报道，应用N-乙酰半胱氨酸治疗大鼠胰腺炎模型，胰腺病变反而加重，血淀粉酶升高，这可能和药物的毒副作用以及用药时机有关。在预实验中，我们采用了0.1 mg/kg、0.2 mg/kg、0.5 mg/kg、1.0 mg/kg 4种剂量的PS-341做治疗，最终证实0.5 mg/kg是最佳的药物浓度。本实验用0.5 mg/kg PS-341治疗胰腺炎肺损伤，不但肺损伤减轻，而且血淀粉酶明显降低，胰腺损伤也明显减轻[7]。

[1]Bhatia M,Moochhala S.Role of inflammatory mediators in the pathophysiology of acute respiratory distress syndrome [J].J Pathol,2004,202(2):145-156.

[2]Bhatia M,Brady AK,Hofbauer B,et al.The effects of neutrophil depletion on a completely noninvasive model of acute pancreati⁃tis-associated lung injury[J].Int JPancreatol,1998,24(2):77-83.

[3]Wang Y,Thorlacius H.Mast cell-derived tumour necrosis fac⁃tor-alpha mediates macrophage inflammatory protein-2-induced recruitment of neutrophils in mice[J].Br J Pharmacol,2005,145 (8):1062-1068.

[4]Bhatia M,Wong FL,Cao Y,et al.Pathophysiology of acute pancre⁃atitis[J].Pancreatology,2005,5(2-3):132-144.

[5]R Horuk,M Bhatia.Treatment With BX471,a Nonpeptide CCR1 Antagonist,protects Mice Against Acute Pancreatitis-Associated Lung Injury by Modulating Neutrophil Recruitment[J].Pancreas, 2007,34(2):233-241.

[6]Steinle AU,Weidenbach H,Wagner M,et al.NF-kappaB/Rel ac⁃tivication in cerulean pancreatitis[J].Gastroenterology,1999,116 (2):420-430.

[7]胡雅国,詹银楚,陈丽萍,等.蛋白酶体抑制剂PS-341对重症急性胰腺炎小鼠的治疗机制[J].中国中西医结合外科杂志,2010, 16（6）：667-669.

（收稿：2011-02-16 修回：2011-11-10）

（责任编辑 刘洪斌 田在善）

Experimental Study of Bortezomib in Protecting Acute Pancreatitis-Associated Lung Injury in Mice

JIANG Ren-ya,ZHAN Yin-chu,LIN Shui-quan,et al. Department of surgery,Quzhou people’s hospital,Zheji⁃ang Quzhou（324000）,China

ObjectiveTo observe the therapeutic effect of Bortezomib（PS-341）on experimental acute pancreatitis-associated lung injury in mice.Methods Severe acute pancreatitis was induced by cerulin and li⁃popolysaccharide(LPS)in mice.Thirty minutes before the administration of lipopolysaccharide,the mice were treated either PS-341 or DMSO.Pancreatic inflammation and lung injury were assessed.The expression of inter⁃cellular adhension molecule 1,P-selectin,E-selectin in lung was studied by reverse transcriptase-polymerase chain reaction. Results Treatment with PS-341 significantly protected mice against pancreatitis-associated lung injury by attenuating myeloperoxidase activity,an indicator of neutrophil infiltration,lung morphological changes in histological sections,and down-regulating intercellular adhesion molecule 1,P-selectin,and E-selec⁃tin expression at mRNA in lung compared with DMSO-treated groups(P＜0.05). Conclusion PS-341 may be a promising drug to prevent disease progression in acute hemorrhagic necrotizing pancreatiits by interfering with neutrolphil infiltration.

Acute hemorrhagic necrotizing pancreatitis，Lung injury,ICAM-1,Selectin，Bortezomib

R656.6；Q95-33

A

1007-6948(2012)01-0043-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2012.01.013

浙江省科技厅资助项目（2006C33077）

浙江省衢州市人民医院肝胆外科（衢州 324000）

姜仁鸦,E-mail:yaya20011222@126.com