载脂蛋白E在ABCA1和ABCG1介导的胆固醇流出中的作用

卢彦珍， 张翠英， 张丽丽， 宋 娟， 贾建桃

(长治医学院1病理生理学教研室，2生理学教研室，山西长治046000)

载脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)是低密度脂蛋白受体(low－density lipoprotein receptor，LDLr)与肝细胞乳糜微粒残粒受体的配体，主要介导血浆脂蛋白特别是乳糜微粒和低密度脂蛋白的代谢与清除，ApoE缺乏则会导致血液循环中富含胆固醇的物质增加。在ApoE基因敲除(ApoE－/－)的小鼠模型中，由于血浆中脂质代谢障碍，聚集的脂质被巨噬细胞吞噬后能够诱导巨噬细胞转化为泡沫样细胞，出现早期动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)斑块的特征性改变［1］。

脂质摄入和流出的不平衡是脂质在巨噬细胞内聚集的一个重要原因［2］。ATP结合盒转运蛋白A1 (ATP－binding cassette transporter A1，ABCA1)和G1 (ATP－binding cassette transporter G1，ABCG1)分别负责把细胞内的脂质转运至细胞外的载脂蛋白A－I (apolipoprotein A－I，ApoA－I)和高密度脂蛋白(high－density lipoprotein，HDL)，在维持细胞内胆固醇的动态平衡，进而阻止脂质在巨噬细胞内的聚集中发挥着重要作用［3－4］。因此，促进胆固醇流出已成为防治AS的靶点之一。本研究旨在通过观察ApoE在巨噬细胞胆固醇流出中的作用，及其对胆固醇流出过程中ABCA1和ABCG1表达水平的调节，探讨ApoE调节胆固醇流出的机制。

材料和方法

1 材料与试剂

RAW 264.7细胞系购自ATCC细胞库，DMEM粉末培养基、新生牛血清(fetal bovine serum，FBS)和双抗均购自Gibco。［1，2－3H(N)］－胆固醇购自PerkinElmer，人ApoA－I、HDL、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)及 RIPA细胞裂解液均购自Sigma。ABCA1、ABCG1和β－actinⅠ抗及辣根过氧化物酶结合的Ⅱ抗购自Santa Cruz。高脂饲料购自北京科澳协力有限公司，含脂肪15%，胆固醇1.25%。游离胆固醇(free chol esterol，FC)和总胆固醇(total cholesterol，TC)检测试剂盒购自普利莱基因技术有限公司。逆转录试剂盒购自TaKaRa，实时荧光定量PCR试剂购自ABI，BCA蛋白定量试剂购自Pierce。

2 方法

2.1 动物及脂蛋白分离 10只12周龄雄性ApoE－/－小鼠购自北京大学实验动物中心，10只12周龄雄性LDLr基因敲除(LDLr－/－)小鼠购自南京大学模型动物研究所。所有实验动物高脂饮食喂养4 d，禁食12 h后收集血浆，然后用两步密度梯度离心法分离血浆低密度脂蛋白(low－density lipoprotein，LDL)［5］。分离得到的LDL经透析、过滤除菌和浓缩后，用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定其纯度，并用BCA法检测蛋白浓度。

2.2 透射电镜技术检测脂蛋白在巨噬细胞内的聚集 分别用20 mg/L LDLr－/－小鼠脂蛋白、ApoE－/－小鼠脂蛋白和单纯培养基处理生长在6孔板中的细胞，48 h后更换为不含任何脂蛋白的培养基平衡12 h。用二甲胂酸缓冲液洗涤细胞，将细胞收集至离心管中离心，吸弃上清后，沿管壁缓慢加入2.5%戊二醛固定液，使细胞团块悬浮在固定液中，固定30 min，用二甲胂酸缓冲液充分洗涤后，加入1%四氧化锇进行2次固定，对2次固定后的细胞团块脱水，用环氧树脂包埋后切60 nm薄片，用醋酸铀和柠檬酸铅双染色后镜下扫描。

2.3 细胞内脂质含量的检测 细胞处理方法同上，用不含任何脂蛋白的培养基平衡12 h后，用PBS洗涤细胞2次，每孔细胞中加入1 mL蒸馏水，将细胞收集至离心管中。超声破碎细胞，取10 μL用于蛋白浓度检测，取500 μL样品至15 mL离心管中，加入2 mL氯仿和甲醇混合物(2∶1)，充分振荡混匀后，离心分层溶液，转移1 mL下层溶液至另一离心管中进行真空干燥，用100 μL含10%Triton X－100的异丙醇溶解脂质沉淀。然后根据FC和TC的检测试剂盒的操作流程，根据标准曲线计算细胞FC和TC的含量，胆固醇酯(cholesterol ester，CE)的含量为TC与FC之差，即CE=TC－FC。

2.4 液闪仪技术检测胆固醇流出变化 胆固醇流出实验操作过程参考其它实验室已经建立的方法，并进行了如下调整［6］:以4×104cells/well的密度将Raw 264.7接种至24孔板，每组设3个复孔，接种后第2 d，用浓度为18.5×107Bq/L的［1，2－3H(N)］－cholesterol标记细胞。［1，2－3H(N)］－cholesterol用含0.5%FBS的DMEM稀释，每孔加300 μL，然后再加入终浓度为20 mg/L LDLr－/－小鼠或ApoE－/－小鼠脂蛋白;标记24 h后，用含有0.2%BSA的DMEM洗涤细胞2次，不含BSA的DMEM洗涤1次，然后用不含BSA的DMEM，或者含终浓度为20 mg/L ApoA－I或者HDL的DMEM继续孵育细胞;孵育2 h后收集培养上清至离心管中，离心除去细胞碎片;细胞则用预冷的PBS洗涤2次，然后用0.5 mol/ L NaOH裂解;将细胞上清液和裂解液转移至闪烁瓶中，加入适当比例的闪烁液(比例至少为1∶10)，充分混匀后用液体闪烁仪计数;胆固醇流出用细胞上清液中的计数除以总计数(上清液和细胞裂解液计数的总和)表示。ApoA－I或者HDL介导的胆固醇流出以含有ApoA－I或HDL的胆固醇流出值减去不含ApoA－I或HDL的胆固醇流出值表示。

2.5 Western blotting检测ABCA1和ABCG1在3组中的表达变化 脂蛋白处理细胞6 h后吸弃培养基，用PBS洗涤细胞1次，每孔细胞加入预冷的RIPA裂解液［含50 mmol/L Tris－HCl(pH 7.4)，150 mmol/L NaCl，0.25% 脱氧胆酸钠(Na－deoxycholate)，1% NP40，1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)，1×蛋白酶抑制剂混合物(protease inhibitor cocktail)］，冰上裂解5 min后收集细胞至离心管中，全速离心10 min后转移上清至另一离心管，并采用BCA法测定蛋白浓度。用蛋白上样缓冲液处理样品后取等量蛋白上样，待蛋白充分分离后，将SDS－PAGE胶中的蛋白电转移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上。然后将PVDF膜顺次置于含5%脱脂奶粉的TBST(20 mmol/L Tris－HCl，150 mmol/L NaCl，0.1%Tween 20)中室温封闭1h，封闭液稀释的ABCA1和ABCG1Ⅰ抗(1∶1 000)中4℃过夜，之后用TBST清洗10 min×3次，在封闭液稀释的Ⅱ抗(1∶5 000)中室温孵育1 h，TBST清洗15 min×3次后与ECL反应1 min，置于X线胶片暗盒中显影，根据蛋白表达的情况决定曝光时间。然后用洗脱液洗脱上述PVDF膜上的蛋白显影信号，重新封闭后，用含βactin的Ⅰ抗(1∶5 000)4℃孵育过夜，并按照上述过程进行显影，作为上样参照。显影结果用Bio－Rad公司提供的Quantity One软件测定蛋白条带的光密度进行定量分析。

2.6 实时定量RT－PCR技术检测ABCA1和ABCG1在3组中的表达变化 脂蛋白处理细胞6 h后吸弃培养基，每孔细胞加入1 mL Trizol试剂，按照操作说明提取细胞总RNA，经NanoDrop检测RNA浓度和纯度。取400 ng总RNA用逆转录试剂盒，按照操作说明，将RNA逆转录为cDNA。目的基因ABCA1和ABCG1扩增时，分别稀释cDNA至10 mg/L和1 mg/L作为扩增ABCA1、ABCG1和内参照GAPDH的模板，按照实时荧光定量PCR试剂和ABIPRISM®7900HT的操作说明进行实时定量PCR反应。总反应体系为10 μL，包括2×SYBR® Premix Ex TaqTMII 5 μL，10 μmol/L引物0.8 μL，模板1 μL，DEPC水3.2 μL。反应条件为:95℃ 30 s;95℃ 5 s，60℃ 30 s，40个循环;72℃ 30 s。利用Sequence Detection System(SDS)Software 2.4对实验数据进行分析，计算ABCA1和ABCG1相对于内参照GAPDH的表达量。实验中使用的引物分别为:ABCA1上游引物5’－AACATGGACATCCTGAAGCC－3’，下游引物5’－ATGTCGCTCCAGCTCTTTGT－3’;ABCG1上游引物5’－TCAACAGTGGAGAGCTGGTG－3’，下游引物5’－TGAACAGTGAGGTGAGGCAG－3’。

3 统计学处理

结果

1 ApoE－/－小鼠脂蛋白在巨噬细胞内聚集

透射电镜显示，与对照组相比，用LDLr－/－小鼠脂蛋白处理后细胞内脂滴数量及体积并未明显改变，但是用ApoE－/－小鼠脂蛋白处理48 h后，细胞内脂滴数量明显增加，脂滴体积明显增大，提示用ApoE－/－小鼠脂蛋白处理后，巨噬细胞已经呈现泡沫样变化，见图1。

Figure 1.The accumulation of ApoE－/－mouse lipoprotein in macrophages.图1 ApoE－/－小鼠脂蛋白在巨噬细胞内的聚集

图2所示，与对照组相比，用LDLr－/－小鼠脂蛋白处理后细胞内脂质含量并未明显改变，但是用ApoE－/－小鼠脂蛋白处理48 h后，细胞内CE增加了60%;细胞内FC含量无明显变化。

Figure 2.The accumulation of ApoE－/－mouse lipoprotein in macrophages.A:cholesterol ester;B:free cholesterol.±s.n=3.*P＜0.05 vs control group.图2 ApoE－/－小鼠脂蛋白在巨噬细胞内的聚集

2 ApoE－/－小鼠脂蛋白降低巨噬细胞胆固醇流出

图3所示，与LDLr－/－小鼠脂蛋白处理组相比，用ApoE－/－小鼠脂蛋白处理后，巨噬细胞胆固醇流出至ApoA－I和HDL的量均明显降低，表明ApoE－/－小鼠脂蛋白在巨噬细胞内的聚集与胆固醇流出降低有关。

Figure 3.Cholesterol efflux mediated by ABCA1(A)and ABCG1(B).±s.n=3*P＜0.05 vs LDLr－/－group.图3ABCA1和ABCG1介导的胆固醇流出

3 ApoE－/－小鼠脂蛋白降低ABCA1和ABCG1的蛋白表达

如图4所示，与对照组相比，LDLr－/－小鼠脂蛋白和ApoE－/－小鼠脂蛋白处理显著增加ABCA1和 ABCG1的蛋白表达，但是 ApoE－/－小鼠脂蛋白对ABCA1和ABCG1蛋白表达的诱导程度明显低于LDLr－/－小鼠脂蛋白处理组细胞，说明低水平的蛋白表达与低水平的胆固醇流出是相一致的。

Figure 4.The protein expression of ABCA1 and ABCG1.±s.n=3.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs LDLr－/－group.图4ABCA1和ABCG1的蛋白表达

4 ApoE－/－小鼠脂蛋白降低ABCA1和ABCG1的mRNA水平

如图5所示，LDLr－/－小鼠脂蛋白和ApoE－/－小鼠脂蛋白处理显著增加ABCA1和ABCG1的mRNA水平，但是ApoE－/－小鼠脂蛋白对ABCA1和ABCG1 mRNA水平的诱导程度明显低于LDLr－/－小鼠脂蛋白处理组细胞。

Figure 5.The mRNA levels of ABCA1 and ABCG1.±s.n=3.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs LDLr－/－group.图5 ApoE－/－小鼠脂蛋白从转录水平对ABCA1和ABCG1表达的调节

讨论

脂质在巨噬细胞内聚集引起巨噬细胞泡沫样改变是AS的特征性病理变化。脂质摄入和流出的不平衡是脂质在巨噬细胞内聚集的一个重要原因［2］。本次研究中，我们主要观察到ApoE－/－小鼠脂蛋白显著降低胆固醇流出至ApoA－I和HDL，引起脂质在巨噬细胞内聚集。同时我们也观察到，ApoE－/－小鼠脂蛋白导致胆固醇流出的减少与ABCA1和ABCG1的蛋白表达水平降低有关。

胆固醇从巨噬细胞内流出是胆固醇逆向转运过程中最关键的一个步骤，如果胆固醇从巨噬细胞内流出至细胞外接受体ApoA－I和HDL的过程发生障碍，会引起大量胆固醇在细胞内聚集［7］。Tangier疾病是一种罕见的遗传性疾病，Tangier疾病患者的肝脏、脾脏以及其它许多组织器官的巨噬细胞内均可发现胆固醇和胆固醇酯聚集，这主要是由于那些患者ABCA1突变而丧失转运胆固醇的功能所致［8］。Yvan－Charvet等［9］研究发现，与Tangier疾病患者相似，ABCA1和ABCG1基因敲除小鼠也因巨噬细胞胆固醇流出至ApoA－I和HDL的水平降低而加速小鼠AS的进程。Lu等［10］在最近的一项研究中指出，促红细胞生成素能够促进巨噬细胞胆固醇流出，进而抑制脂质在巨噬细胞内的聚集，阻止巨噬细胞发生泡沫样改变;与此相反，当抑制细胞胆固醇流出过程后，则有大量的脂质在巨噬细胞内聚集。我们本次的研究结果也证实胆固醇流出在维持巨噬细胞内胆固醇动态平衡中的作用，同时我们也发现，用ApoE－/－小鼠脂蛋白处理细胞后，流出至ApoA－I和HDL的胆固醇量明显降低，表明ApoE缺失在一定程度上抑制胆固醇流出，进而导致脂质在巨噬细胞内的聚集。

胆固醇流出与ABCA1和ABCG1的表达水平密切相关。Lu等［10］的研究主要集中在促红细胞生成素通过增加ABCA1和ABCG1的表达进而调节巨噬细胞的胆固醇流出状况，提示ABCA1和ABCG1作为转运体发挥作用，在细胞受到外来干扰时尽量把细胞内多余的脂质转运出去，达到保护细胞的目的。与上述观察相一致，我们的实验结果也显示，当用脂蛋白处理巨噬细胞时，细胞表面ABCA1和ABCG1的蛋白表达都上调，只是上调程度有差异。诸如，LDLr－/－小鼠脂蛋白和ApoE－/－小鼠脂蛋白处理显著增加ABCA1和ABCG1的蛋白表达，但是ApoE－/－小鼠脂蛋白对ABCA1和ABCG1蛋白表达的诱导程度明显低于LDLr－/－小鼠脂蛋白处理组细胞。这表明，ApoE在调节ABCA1和ABCG1蛋白表达水平进而维持胆固醇从巨噬细胞内流出平衡的过程中发挥了重要作用，本实验中对ABCA1和ABCG1转录水平的研究进一步支持了上述观点。

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