miR－183在人乳腺癌中表达及意义*

吴正升， 吴 强

(安徽医科大学病理学教研室，安徽合肥230032)

肿瘤的侵袭和转移是其难以根治和患者死亡的主要原因。肿瘤侵袭转移是一个复杂的和多步骤的过程，很多因子参与了这一过程。近年来，研究发现微小RNA(microRNA，miRNA)也参与了多种恶性肿瘤的发生和发展过程，它们通过调控其靶基因的表达在细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭和转移等很多过程中发挥了重要作用［1－3］。本课题组前期通过miRNA芯片检测了不同侵袭活性的人乳腺上皮细胞株的miRNA表达谱，发现很多miRNA出现了显著的差异性表达，可能与乳腺细胞侵袭活性有一定的关系［4－5］。在这些差异性表达的miRNA中包括了miR－183，其表达在高侵袭乳腺癌细胞MDA－MB－231和MDA－MB－468中较低侵袭细胞MCF－7和HBL－100显著下调。在本研究中，我们将首先使用实时定量PCR方法验证前期芯片中miR－183的表达结果，同时进一步检测临床人乳腺癌和良性病变组织中miR－183表达。然后，我们将在体外以乳腺癌MCF－7和MDA－MB－231细胞为模型，使用miRNA转染技术，分析miR－183对乳腺癌细胞增殖、侵袭和迁移活性的影响，试图为认识乳腺癌的侵袭和转移提高新的理论线索。

材料和方法

1 材料

1.1 细胞株和病人材料 人乳腺上皮细胞系HBL－100，人乳腺癌细胞系MCF－7、MDA－MB－231和MDA－MB－468均购自美国典藏细胞库(ATCC);收集安徽医科大学第一附属医院2009年7月～2010年6月间乳腺病例29例，其中乳腺癌18例，乳腺良性病变(纤维腺瘤和/或腺病)11例，患者均为女性，所有患者术前未做化疗、免疫或放射等抗肿瘤治疗。所有新鲜组织切除后快速置于液氮速冻后储存于－70℃，直到RNA的抽提。

1.2 主要试剂 RPMI－1640培养基、L15培养基和DMEM高糖培养基购自Corning;胎牛血清购自Hy-Clone;miRNA提取试剂盒和miR－183模拟物(mimic)、荧光定量PCR检测试剂盒均购自Ambion;脂质体转染试剂购自Invitrogen;miR－183模拟物(mimic)、抑制物(inhibitor，即反义寡核苷酸，antisense oligonucleotide，ASO)和阴性对照(negative control，NC)购自上海吉玛制药技术有限公司;MTS细胞增殖检测试剂盒购自Promega;侵袭小室购自Corning;基质胶购自BD。

2 方法

2.1 检测细胞株和新鲜组织中miR－183的表达HBL－100细胞培养于DMEM培养基中，MCF－7细胞培养于RPMI－1640培养基中，MDA－MB－231和MDA－MB－468细胞培养于L15培养基中，均添加10%胎牛血清。10 cm细胞培养皿隔天传代扩增HBL－100、MCF－7、MDA－MB－231和MDA－MB－468细胞，待细胞状态良好，近90%融合时，以预冷PBS冲洗3次终止培养，冰上用刮棒刮取细胞，移入离心管，4℃、8 000 r/min离心10 min，去上清，收集细胞，备用;取乳腺新鲜组织100 mg，置于液氮预冷处理的研钵中，固化、研碎，备用。按照miRNA提取试剂盒说明，分别抽提4株细胞系和乳腺新鲜组织中总miRNA。按照Ambion公司的mirVanaTMqRT－PCR miRNA检测试剂盒说明，首先对各个细胞系和新鲜组织总miRNA进行逆转录，然后在实时定量PCR仪上进行PCR扩增，使用U6作为内参照。

2.2 miR－183 ASO和mimic的转染 选择乳腺癌细胞MCF－7和MDA－MB－231为模型，细胞接种后24 h，待贴壁细胞达到30%～50%时进行转染，参照脂质体转染试剂说明书转染miR－183 ASO、miR－183 mimic和NC。

2.3 细胞增殖活性的检测 取转染36 h后miR－183 ASO组和NC组MCF－7细胞，以及miR－183 mimic组和NC组的MDA－MB－231细胞，按照MTS细胞增殖检测试剂盒说明，分别于接种96孔板后24、48、72和96 h各检测1次。每组设6个复孔。实验重复3次。

2.4 细胞侵袭和迁移活性的检测 取转染48 h后miR－183 ASO组和NC组MCF－7细胞，以及miR－183 mimic组和NC组的MDA－MB－231细胞，在Transwell小室接种细胞前1 d，在小室底部膜的上室面铺基质胶(迁移实验不加基质胶)，按照Transwell小室说明，将侵袭小室下室加入含10%FBS RPMI－1640培养基，将侵袭小室上室加入各组细胞悬液。将侵袭小室置于37℃、5%CO2培养箱培养24～48 h，倒置显微镜下观察侵袭小室下室，待少量细胞穿出后终止实验。用棉签擦去基质胶和上室内细胞，4%多聚甲醛固定，0.25%考马斯亮蓝染色。正置显微镜下进行观察拍照，采用5个视野进行细胞计数，取平均值进行统计学分析。

3 统计学处理

采用SPSS 10.0进行统计学处理。临床乳腺病变组织中miR－183的表达用中位数(median)、四分位数间距(interquartile range)和极差(range)表示，组间比较用Wilcoxon秩和检验;其余数据用均数±标准差(±s)表示，两组间均数比较用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 miR－183在乳腺上皮细胞系和临床乳腺病变组织中表达

本课题组前期使用miRNA芯片检测了人乳腺细胞系 HBL－100、MCF－7、MDA－MB－231和MDA－MB－468的miRNA表达谱［4－5］，其中高侵袭细胞系MDA－MB－231和MDA－MB－468中miR－183表达均较低侵袭HBL－100和MCF－7细胞显著下调，见图1。本研究进一步使用实时荧光定量PCR方法检测了这4株细胞miR－183表达，其结果与芯片结果一致，即MDA－MB－231和MDA－MB－468细胞中miR－183表达较HBL－100和MCF－7细胞显著下调(P＜0.01)，见图1。18例人新鲜乳腺癌组织miR－183表达也较11例乳腺良性病变组织显著下调(P＜0.01)，见图2。

Figure 1.Expression of miR－183 in human breast cell lines detected by miRNA microarray and real－time PCR s.n=3.＊＊P＜0.01 vs HBL－100 or MCF－7.图1 miR－183在人乳腺上皮细胞株中表达

Figure 2.Expression of miR－183 in human breast disease tissue specimens.The data were presented as box plot (bold horizontal lines within the boxes represent the medians;lower and upper borderlines of the boxes represent the 1st and 3rd quartiles，respectively;lower and upper whiskers represent the minimum and maximum，respectively).＊＊P＜0.01 vs benign breast disease.图2 miR－183在临床人乳腺病变组织中表达

2 miR－183对乳腺癌细胞MCF－7和MDAMB－231增殖活性的影响

miR－183 ASO组与NC组相比，miR－183 mimic组与NC组相比，各个时点细胞的增殖数目差异均无统计学意义(均P＞0.05)。

3 miR－183对乳腺癌细胞侵袭和迁移活性的影响

如图3所示，通过转染miR－183 ASO下调MCF－7细胞内源性miR－183表达，能够显著促进乳腺癌细胞穿过基质胶的侵袭能力，以及迁移至小室膜的能力(未加入基质胶的迁移实验)，即细胞的侵袭和迁移能力均较对照组显著提高(均P＜0.01);如图4所示，通过转染miR－183 mimic上调MDAMB－231细胞内源性miR－183表达，能够显著抑制乳腺癌细胞穿过基质胶的侵袭能力，以及迁移至小室膜的能力，即细胞的侵袭和迁移能力均较对照组显著降低(均P＜0.01)。

讨论

Figure 3.Migration and invasion assay on MCF－7 cells transfected with miR－183 ASO and negative control.±s.n=5.＊＊P＜0.01 vs negative control.图3 MCF－7细胞转染miR－183抑制物和阴性对照后的迁移和侵袭实验

Figure 4.Migration and invasion assay on MDA－MB－231 cells transfected with miR－183 mimic and negative control.±s.n=5.＊＊P＜0.01 vs negative control.图4 MDA－MB－231细胞转染miR－183模拟物和阴性对照后的迁移和侵袭实验

miRNAs不仅在调控生物体各种生理活动和生长发育中发挥重要作用，而且与肿瘤的发生发展也有着密切关系［2－3，6－7］。miRNA在乳腺癌方面的研究也是研究热点之一。Valastyan等［8］使用动物实验发现了miR－31可以通过调控RhoA等3个靶基因表达抑制乳腺癌细胞的局部侵袭和远处转移。Gregory等［9］发现miR－200家族成员通过作用于ZEB1和SIP1调节乳腺癌细胞上皮－间质转化(epithelial－mesenchymal transition，EMT)过程，二者是E－cadherin的转录抑制因子。Sempere等［10］用原位杂交的方法检测了乳腺组织中miR－205的表达，发现miR－205只在正常肌上皮细胞中表达，而在乳腺恶性病变区的肌上皮细胞中表达量下调甚至完全消失，说明miR－205表达量的减少可能与乳腺肿瘤的恶性演进有关。Foekens等［11］利用miRNA表达谱分析研究了38例雌激素受体阳性无淋巴结转移的乳腺癌样本，发现4种miRNAs(miR－7、miR－128a、miR－210和miR－516－3p)与乳腺癌的演进有关。Ma等［12］研究发现，miR－10b在乳腺癌细胞中显著上调，外源性导入miR－10b可以使无侵袭力的乳腺癌细胞转变为高侵袭力细胞，进一步发现miR－10b是通过参与Twist基因介导的转移过程发挥作用的。这些研究结果显示miRNA可能参与了乳腺癌的发生和发展过程。

本研究前期通过miRNA芯片技术检测不同侵袭特性的人乳腺细胞株［4－5］，试图筛选出可能参与乳腺癌侵袭过程的miRNA。miR－183的miRNA芯片结果显示，高侵袭性的MDA－MB－231和MDAMB－468中miR－183表达较低侵袭HBL－100和MCF－7细胞显著下调。为此，本研究通过实时荧光定量PCR技术验证了miRNA芯片中miR－183表达数据，两者结果一致，提示了miRNA芯片结果的可靠性。我们在临床乳腺新鲜病变组织中再次检测了miR－183的表达，结果显示乳腺癌组织中miR－183出现了显著下调。这些细胞株和临床组织的结果提示miR－183的失调可能参与了乳腺癌发生和发展的过程。但miR－183具体的功能是什么，对乳腺癌细胞生物学行为有何影响，目前尚不明了。为阐明这些问题，我们使用化学合成的miR－183抑制物转染乳腺癌细胞，人为下调细胞内源性miR－183表达，然后观察转染后细胞增殖、侵袭和迁移活性的改变。结果发现外源性下调miR－183对细胞增殖影响不明显，但可以显著促进乳腺癌细胞的侵袭和迁移。Wang等［13］同样使用miRNA芯片和实时荧光定量PCR技术检测高转移和低转移肺癌细胞株miRNA表达谱，发现miR－183在高转移肺癌细胞95C中表达显著下调，并且发现miR－183通过调控其靶基因 Ezrin表达抑制肺癌细胞侵袭转移。Lowery等［14］通过转染乳腺癌细胞 miR－183前体(premiR－183)来过表达细胞内源性miR－183水平，功能实验显示过表达miR－183能够显著抑制乳腺癌细胞的迁移，结果与我们一致，提示miR－183在乳腺癌中可能扮演了抑癌基因角色，参与了乳腺癌细胞侵袭和迁移过程。

综上所述，本研究在前期工作的基础上，证实了miR－183失调是乳腺癌发病的一个现象，并且miR－183具有抑制乳腺癌细胞侵袭和迁移的功能，提示miR－183可能参与了乳腺癌的发生和进展。

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