多巴反应性肌张力障碍患者的GCH1基因突变检测

陈延国 崔桂云 沈 霞 牟英峰△

多巴反应性肌张力障碍（dopa－responsive dystonia，DRD）是一种临床上较为少见的遗传性运动障碍疾病，发病率约1／200万，最早由Segawa［1］报道，又称Segawa病。Ichinofe等［2］首次将DRD致病基因精确定位于14q22.1－22.2，并发现4种突变。到现在为止，世界范围内关于GCH1突变的报道100多种，已知突变位点90%以上位于GCH1基因1～6号外显子上，少数位于内含子部分（http：／／www.hgmd.org）。GCH1基因表达的蛋白产物GTP环化水解酶1（GCH1），是BH4生物合成过程中的限速酶，而BH4作为重要的生物活性物质，参与苯丙氨酸代谢和单胺类神经递质的合成［3－5］。已有相关研究发现，GCH1基因突变通过引起GCH1蛋白合成水平及活性下降，从而导致DRD的发病［6－7］。

目前关于DRD患者的诊断以临床症状为主要依据，误诊率高。我们对徐州地区21例散发型多巴反应性肌张力障碍患者的GCH1基因进行检测，以探索GCH1基因检测作为DRD早期诊断工具的可行性。

1 对象与方法

1.1 研究对象 21例DRD患者均来自徐州医学院附属医院门诊及住院病人，均符合DRD的诊断标准［1，8］。所有病人均知情同意，并定期随访。

1.2 主要试剂 血液基因组DNA提取试剂盒离心柱型，购自天根生化科技（北京）有限公司；DNA分子量标记Marker 1，购自天根生化科技（北京）有限公司；2×Taq PCR Master Mix（不含染料）购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标本采集：取肘静脉血5mL，EDTA抗凝，－20℃冰箱保存。

1.3.2 基因组DNA的提取：应用天根公司的全血基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）提取血样中DNA。DNA产物保存在－20℃，以防DNA降解。

1.3.3 引物设计与合成：使用加拿大生物研究所提供的Primer3在线软件（http：／／www－genome.wimit.edu／cgi－bin／primer3.cgi／）设计引物，由生物工程（上海）有限公司负责合成。设计引物见表1。

表1 GCH1基因PCR扩增引物序列

1.3.4 聚合酶链反应（PCR）及扩增产物检测：25μL反应体系：基因组DNA 2μL，上游引物1μL，下游引物1μL，2× Taq PCR Master Mix 12.5μL，双蒸水8.5μL。反应条件：95℃预变性3min，95℃变性5min，60℃（exon1）退火45s，30个循环；72℃充分延伸10min 4℃保存。上述为exon1的反应条件。exon2、exon5及exon6的退火温度59℃，exon3、exon4的退火温度58℃。扩增产物经聚丙烯酸胺凝胶电泳。电泳后凝胶经固定液固定、染色液染色、一蒸水漂洗、显色液显色，最后拍照或用图像处理系统进行扫描。

1.3.5 GCH1基因测序：全部测序工作由上海生物工程公司测序部完成，DNA测序图由其提供。

2 结果

2.1 聚丙烯胺凝胶电泳检测 电泳图提示扩增产物片段长度100～500bp，符合目标片段长度，均为单一目的条带，特异性好，提示扩增成功。见图1。

2.2 GCH1基因测序 GCH1基因外显子编码序列未发现基因突变。仅在4份样本的1号外显子发现了1个碱基变异，通过查询NCBI的SNP数据库，该碱基变异为单核苷酸多态（SNP）。该SNP位于GCH1基因1号外显子，第68位的碱基C／T多态，不存在氨基酸的改变。部分外显子测序结果见图2、图3。

图1 PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳1：Marker；2、3：exon1；4、5：exon2；6：exon3；7：exon4；8、9：ex－on5；10、11：exon6

图2 Exon1测序图，箭头所示为所发现的单核苷酸多态位点c.68C＞T

图3 Exon2测序图，未发现碱基改变

3 讨论

本研究中，我们对徐州地区21例散发型多巴反应性肌张力障碍患者的GCH1基因进行检测，未发现基因突变。但中国各地均有研究陆续报道了DRD患者GCH1基因突变［9－11］。在对本地区21例多巴反应性肌张力障碍患者研究中未发现GCH1基因突变，由于本组DRD患者没有家族史，有报道称DRD也可能存在其他致病基因［12］。

我们的测序结果仅在4份样本的1号外显子发现了1个碱基变异，通过查询NCBI的SNP数据库，该碱基变异为SNP。该SNP位于GCH1基因1号外显子，第68位的碱基C／T多态，不存在氨基酸的改变。Jorge等［13］研究单核苷酸突变对剪切的影响，还推测其可能与遗传多样性相关。而通过关联分析、生化、细胞水平等方面的研究，SNP可能通过基因转录水平、转录后水平、翻译水平、翻译后蛋白修饰剂蛋白细胞的定位等多种平台对基因功能表达产生影响［14］。我们所检测到的SNP位点是否与DRD的发病相关，需要进一步研究。

目前DRD的诊断主要通过临床症状。虽然该病具有晨轻暮重、小剂量左旋多巴有效、儿童起病多见等临床特点，但临床表现多样，头颅MRI、CT、脑电图检查缺乏特异性，故仍有较高的漏诊或误诊率。我们进行本研究的目的是检验基因突变检测是否可以用于诊断DRD，我们的研究结果不支持GCH1基因突变检测是诊断DRD的生物学标记。

综上所述，DRD患者可能存在其他致病基因，GCH1基因突变检测目前仍不能作为该病早期诊断的依据，仍然需要继续深入DRD致病基因的研究，筛查新的致病基因，为DRD的早期诊断探索新的依据。

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