γ-氨基丁酸代谢旁路阻断对苏云金芽胞杆菌芽胞形成和晶体蛋白产量的影响

王 维，高继国，朱 莉，彭 琦，束长龙，张 杰，黄大昉，宋福平

（1.东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030；2.中国农业科学院植物保护研究所，植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193；3.中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081）

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一种四碳非蛋白质类氨基酸，广泛存在于原核生物和真核生物中，在不同的生物体中具有不同的生理功能。GABA代谢是通过γ-氨基丁酸旁路（GABA shunt）来完成的[1]。关于GABA shunt相关研究在动植物中一直非常活跃，而在微生物中研究较少，尤其是对芽胞杆菌中GABA shunt研究。研究发现，在细菌中参与GABA shunt的基因有形成基因簇的特点，在大肠杆菌中参与GABA shunt的基因组成csiD-ygaF-gabDTP基因簇，受σs因子调控，而σs因子又受pH和氮碳源营养等环境压力影响[2]。而在枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）中，编码γ-氨基丁酸转氨酶的gabT基因与编码琥珀酸半醛脱氢酶的gabD基因组成一个操纵子，同时发现一个编码转录调节蛋白GabR的反向基因gabR[3]。Bt中的gab基因簇有两个转录单元，其中gabT基因单独转录，而gabR和gabD基因组成一个转录单元，它们都受到σ54因子的调控，而gabR基因编码的GabR蛋白是依赖于σ54因子的转录激活因子，并也正调控gab基因簇[4]。

在微生物中，对GABA旁路的功能研究相对较少。在啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中，GABA对细胞中氧化还原反应的影响起缓冲作用[5]。在芽胞杆菌中，GABA shunt可能与芽胞萌发有一定关系，一些芽胞杆菌在芽胞萌发过程中必须有GABA参加，对GABA有高度的特异性[6]。GABA还可以操控根癌农杆菌群体信号级别，GABA是作为一种分子信号介导根癌农杆菌与植物愈伤组织之间的联系[7-8]。

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis， Bt）以其安全、高效的杀虫特点成为应用最为广泛的杀虫微生物，并被应用于重要的转基因作物，苏云金芽胞杆菌与其他芽胞杆菌最显著的差别在于其能在形成芽胞的同时产生具有杀虫活性的晶体蛋白（δ-内毒素）[9-12]。研究发现，在苏云金芽胞杆菌与伴胞晶体合成的过程中，γ-氨基丁酸代谢途径相关酶活性有所变化，推测该代谢途径可能参与芽胞和晶体形成[12]，但之后并未见相关研究报道。

本研究利用gab基因簇突变体分析GABA shunt阻断对菌株生长、产芽胞能力和晶体蛋白产量影响。通过关键基因缺失阻断代谢途径来研究代谢与苏云金芽胞杆菌晶体形成的关系，为研究该领域提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和培养基

所用菌株见表1，苏云金芽胞杆菌培养采用芽胞形成培养基（Schaeffer's sporulation medium，SSM：营养肉汤8 g,12%MgSO410 mL，10%KCl 10 mL，1 mol·L-1NaOH 1 mL，定容至997 mL，1×105Pa 灭菌30 min,补加过滤除菌的1 mmol·L-1FeSO41 mL，1mol·L-1Ca（NO3）21mL，10mmol·L-1MnCl21mL）[14]和Luria-Bertani（LB）培养基。

表1 菌株来源及特性Table 1 Characterization and source of strains

1.2 细菌的培养条件

苏云金芽胞杆菌在30℃培养，摇床转速为220 r·min-1。

1.3 不同营养条件下生长曲线的测定

将出发菌株HD-73和突变菌株HD（ΔgabT）、HD（ΔgabR）和HD（ΔgabD）按1%分别接种于营养相对贫瘠的SSM培养基、加入2%GABA的SSM培养基和营养相对丰富的LB培养基中，30℃培养，摇床转速为220 r·min-1，每隔1 h取样，测OD600值，取菌体在两种培养基中的OD600最大值，重复3次。

1.4 显微镜观察

利用光学显微镜观察Bt菌株产芽胞和晶体形成的能力。将胞晶混合液滴于载玻片上，涂抹均匀，烘干固定，石炭酸复红染液染色3 min，清水冲洗，100×油镜进行镜检，石炭酸复红染液配制方法参照文献[16]。

1.5 活芽胞计数分析

取已完全释放芽胞的Bt培养液进行适度稀释，80℃热处理15 min后涂营养平板，24 h后记数平板上长出的单克隆，即为活芽胞数。

1.6 菌株表达杀虫晶体蛋白能力分析

将各菌株分别接种于SSM液体培养基和LB液体培养基中220 r·min-1、30℃培养，SSM中培养到T12和T24取样（T0代表生长对数期终止的时间点，Tn为此时间点后n小时），LB中培养到T20和T40取样，12000 r·min-1离心1 min，取适量50 mmol·L-1Na2CO3重悬至OD600值一致，取相同量菌液，经破碎后，利用SDS-PAGE检测菌株产生的杀虫晶体蛋白，方法参照文献[17]。

2 结果与分析

2.1 gab基因簇基因缺失对菌株生长的影响

生长曲线的结果表明，SSM液体培养基培养至12 h与LB液体培养基培养至18 h，HD-73与各突变菌株的OD600值相差不大。在SSM液体培养基中，出发菌株和各突变株在4 h左右结束对数生长期，进入平稳期；SSM液体培养基中加入2%GABA时，各菌株的生长情况也未发现受到影响（见图1-A、B）。LB液体培养基中，出发菌株和各突变株6 h左右结束对数生长期，进入平稳期（见图1-C）。说明gab基因簇的缺失没有影响菌株生长。

2.2 gab基因簇基因缺失对菌株产生活芽胞数的影响

将HD-73和各突变株在SSM液体培养基中培养至芽胞完全释放，各取1 mL菌液进行活芽胞计数（见图2）。

图2 出发菌株和突变菌株的活芽胞计数分析Fig.2 Numeration of live spore in wild-type and mutant strains

出发菌株HD-73每毫升菌液可产生1.97×107个活芽胞，而HD（ΔgabT）每毫升仅产生4.9×106个活芽胞，HD（ΔgabD）每毫升仅产生4.6×106个活芽胞。这说明gabT基因和gabD的缺失，导致菌体芽胞产量下降。HD（ΔgabR）每毫升产生1.2×107个活芽胞，芽胞产量比HD-73有所下降，比HD（ΔgabT）和HD（ΔgabD）产量有所提高。

2.3 gab基因簇基因缺失对晶体蛋白产量的影响

将HD-73和各突变株分别在SSM和LB液体培养基中30℃，220 r·min-1培养，每2 h取样，在光学显微镜下观察芽胞裂解情况。SSM液体培养基中培养到T24时芽胞完全裂解，分别在T12和T24取样，LB液体培养基中培养到T40时芽胞完全裂解，分别在T20和 T40取样。

SDS-PAGE结果表明，无论在SSM液体培养基中还是在营养丰富的LB液体培养基中培养，HD-73和突变菌株都可以产生130 ku的晶体蛋白，蛋白表达量没有明显差异（见图3-A、B）。在SSM液体培养基中加入2%GABA，分别在T12和T24取样，SDS-PAGE结果表明，GABA的加入对各菌株产生晶体蛋白量无显著影响（见图3-C、D）。以上结果表明，GABA代谢旁路的阻断并没有显著影响晶体蛋白产量。

图3 出发菌株和突变菌株晶体蛋白SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis for crystal protein of wild-type and mutant strains

3 讨论

Aronson等通过酶活分析推测苏云金芽胞杆菌GABA shunt与晶体形成有关[13]。本实验室前期对苏云金芽胞杆菌GABA shunt相关基因簇的表达调控方式进行研究，获得该基因簇的相关基因突变体HD（ΔgabT）、HD（ΔgabR）和 HD（ΔgabD）。发现 HD（ΔgabT）完全阻断GABA shunt，而且HD（ΔgabD）并未阻断该代谢途径，Bt中有分别依赖于NADP+和NAD+的两种琥珀酸半醛脱氢酶，其中gabD所编码的琥珀酸半醛脱氢酶是依赖于NADP+的[4]，而依赖于NAD+的琥珀酸半醛脱氢酶可以部分互补该代谢途径。本研究利用三种突变体研究GABA shunt对晶体蛋白产量的影响。发现无论是否阻断该途径，还是在加入2%GABA情况下，晶体蛋白产量均无明显差异，首次明确GABA shunt对苏云金芽胞杆菌的晶体蛋白产量无影响。

研究表明，Bt的一些代谢途径参与芽胞形成过程，例如在葡萄糖培养基中，Bt的代谢产物乙酸可以在芽胞形成初期被利用，并且乙酸水合酶活性也显著提高[18]。Bt中90%脂肪酸存在于芽胞中，脂肪酸代谢途径对其芽胞萌发也有很大影响[18]。以上研究都是从酶学水平研究代谢途径与芽胞形成的关系，而本研究通过分子水平阻断相关代谢途径研究二者的关系，发现Bt突变菌株HD（ΔgabT）、HD（ΔgabR）和HD（ΔgabD）的产芽胞量与出发菌株相比均有不同程度下降，说明该代谢途径是芽胞形成过程所必需的。而突变菌株HD（ΔgabR）的芽胞产量虽然下降却要高于另两个突变菌株，由于gabR基因是调节基因，它的缺失只是降低而不是丧失gabT和gabD基因表达。但是GABA shunt如何影响芽胞产生效率需要更深入分析。

4 结论

a.苏云金芽胞杆菌GABA shunt阻断对菌株生长没有造成明显影响。

b.首次证明GABA shunt对苏云金芽胞杆菌晶体蛋白产量无明显影响。

c.苏云金芽胞杆菌GABA shunt阻断降低菌株产芽胞量，并且不同突变菌株之间产芽胞量也有所不同，证明该代谢旁路对苏云金芽胞杆菌芽胞产量有影响。

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