芽胞杆菌产生的脂肽类化合物在防治油菜菌核病中的作用

伍辉军，王 帅，湛 江，马玲莉，高学文

（南京农业大学植物保护学院，农作物生物灾害综合治理教育部重点实验室，南京 210095）

油菜菌核病是我国油菜第一大病害，该病由核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）de Bary）引起，一般发病率为10%～30%，严重时可达80%以上[1]。油菜菌核病一旦发作，常会连年发生，严重影响油菜产量和质量，造成巨大经济损失，病情严重时，可使油菜减产30%[2]。

目前，尚未发现真正抗核盘菌的油菜种质资源，防治油菜菌核病主要依赖化学防治。然而，化学农药已使核盘菌产生强抗药性[3]，导致化学农药使用量和使用频度不断加大，增加了环境和农产品中农药残留量，对环境和人类健康构成严重威胁。因此，亟需研究和开发新型环保菌核病生物防治药剂。

近年来，生物防治以其无公害、无污染等优点受到广泛关注。目前，在生防领域中，芽胞杆菌（Bacillus spp.）是研究和应用相对较多的一类细菌，该菌分布广泛，能产生抗逆性强的芽胞、多种抗生素和酶类物质[4]。芽胞杆菌防治植物病害的主要活性物质是脂肽类化合物，包括表面活性素（Surfactin）、伊枯草菌素（Iturin）和泛革素（Fengycin）三大类[5]。其中，Surfactin具有抑制病毒和细菌的活性[5]。泛革素对丝状真菌具有很强的抑制效果[6]。伊枯草菌素能有效抑制真菌和细菌[7]。表面活性素和泛革素还能作为激发子诱导植物产生抗病性[8]。因此，可以利用芽胞杆菌产生的这类独特化合物，研制新型环保生物源农药。

本研究检测了芽胞杆菌产生的脂肽类化合物抑制油菜菌核病菌的活性，并采用油菜离体叶片接种法和田间试验，评价脂肽类化合物防治油菜菌核病效果。该研究有助于油菜菌核病的生物防治，以及新型环保生物源农药研制。

1 材料与方法

1.1 材料

油菜品种为Z生3。油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）de Bary）、枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）G4菌株和解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B3菌株为本实验室保存。芽胞杆菌培养采用LB和Landy培养基[9]；真菌培养采用PDA培养基[10]。42%克菌净可湿性粉剂购置于湖南省海洋生物工程有限公司。脂肽类生物农药乳油的制备：芽胞杆菌在Landy培养基中进行发酵，发酵条件参考王帅等方法[11]。发酵结束后，采用酸沉淀法提取脂肽类化合物，并对粗提的脂肽类化合物进行称重，再溶于助溶剂乙醇，最终配制成50 mg·L-1脂肽类生物农药乳油。

1.2 脂肽类生物农药乳油抗菌活性检测

以油菜菌核病菌为指示菌，用纸碟法检测脂肽类生物农药乳油抗菌活性。先用打孔器从培养的菌核病菌上取直径为4 mm的菌丝块，移至PDA平板中央，在距离中央两侧各1.5 cm处放置直径为4 mm滤纸片，在滤纸上加脂肽类生物农药乳油10 μL，对照以无菌水测试，每个试验3个处理，于28℃下培养3 d后测量各处理抑菌圈。

1.3 油菜离体叶片接种试验

在油菜10叶期，摘取叶位一致、大小相近的无破损、无病虫害叶片，自来水清洗，晾干，滴加0.5 mL脂肽类生物农药，涂抹均匀，用灭菌去离子水处理叶片作对照（CK），自然晾干，接种生长旺盛的油菜菌核病菌菌丝块，每片叶片放置2个菌丝块，于25℃保湿培养2 d，然后测量病斑直径。每次处理重复4次。

1.4 脂肽类生物农药乳油防治油菜菌核病的田间试验

试验共设脂肽类生物农药乳油B3、G4、42%克菌净可湿性粉剂和空白对照4个处理。小区面积40 m2，随机区组排列，每个处理重复4次。各药剂使用浓度分别为：脂肽类生物农药每亩40 mL，42%克菌净可湿性粉剂3.34 g·hm-2。分别在油菜的初花期和盛花期施药，每次施药按药量兑水3.34 kg·hm-2，用长江-10A型手动喷雾器均匀喷雾（喷孔直径1.3 mm，工作压力3～4 kg·cm-2），空白对照喷等量清水。于盛花期药后10 d调查1次。每小区棋盘式10点调查，每点调查5株（每个小区50株），调查时不要在边行取样，记载各级发病株数，计算发病率、病情指数和防治效果。采用统计学软件SPSS对上述处理间的试验结果进行差异显著性分析，比较试验中不同处理间差异。

2 结果与分析

2.1 脂肽类生物农药乳油B3和G4对油菜菌核病菌的平板拮抗作用

结果表明，脂肽类生物农药乳油B3和G4均能够明显抑制油菜菌核病菌菌丝生长（见图1）。B3和G4平均抑菌圈面积分别为4.71和3.85 cm2，差异显著性分析表明，抑菌圈在显著性水平5%时各处理间与清水对照间有显著性差异，且B3效果要好于G4；在显著性水平1%时各处理与清水对照存在极显著性差异，B3和G4处理之间无显著性差异。

图1 B3和G4对油菜菌核病菌菌丝生长的影响Fig.1 Inhibition effect of B3 and G4 on S.sclerotinorium in plate

2.2 油菜离体叶片接种核盘菌试验

试验结果表明，在接种核盘菌后24 h，对照叶片开始发病，此时B3和G4处理叶片均未发病（见图2-A）。在接种核盘菌后36 h，对照叶片开始大面积发病，G4处理叶片开始轻微发病，B3处理叶片未发病（见图2-B）；在接种核盘菌后48 h，对照叶片开始大面积腐烂，G4处理叶片有直径为1.5 cm左右的病斑，B3处理叶片未发病，而对照处理的叶片则出现直径为3.7 cm左右的病斑（见图2-C）。差异显著性分析表明，各处理间及与清水对照在显著性水平1%时存在极显著性差异。此外，接种后48 h内，对照逐渐退色，而处理叶片依然鲜绿。

图2 油菜离体叶片上B3和G4对油菜菌核病菌的抑制作用Fig.2 B3 and G4 supress the growth of S.sclerotinorium on detached leaves of rape

2.3 脂肽类生物农药乳油B3和G4防治油菜菌核病的田间试验

试验结果表明，在连续两年的试验中经B3和G4处理后，油菜病株率与病情指数逐年下降，并且在油菜整个生育期都具有很好防治效果（见图3，表1）。第一年B3和G4防效分别达到49.7%和44.8%；第二年B3和G4防效分别达到55.8%和46.3%。与化学农药克菌净在两年内的防效51.5%和47.4%相近。差异显著性分析表明，在第一年试验中，在差异显著性5%时B3与克菌净处理间无显著性差异；G4与克菌净处理间有显著性差异（见表1）。在第二年试验中，在差异显著性5%时B3与克菌净处理间有显著性差异，且B3处理防效高于克菌净；G4与克菌净处理间无显著性差异（见表1）。

图3 脂肽类生物农药乳油防治油菜菌核病Fig.3 Controlling of S.sclerotinorium with biopesticides of lipopeptide

表1 脂肽类生物农药乳油防治油菜菌核病的田间试验Table 1 Controlling of S.sclerotinorium with biopesticides of lipopeptide in the field

2.4 脂肽类生物农药乳油B3和G4对油菜生长的影响和对油菜生长的安全性

油菜经脂肽类生物农药乳油B3和G4处理后，于盛花期药后10 d调查，结果表明，脂肽类生物农药乳油B3和G4处理均具有促进油菜生长的作用（见表2）。每667 m2油菜经脂肽类生物农药乳油B3或G440 mL处理后，油菜株高分别为145.8和144.7 cm，地上部鲜重分别为293.3和261.2 g。差异显著性分析表明，株高方面在显著性水平5%时，脂肽类生物农药乳油B3与清水对照有显著性差异；在显著性水平1%时各处理与清水对照均无显著性差异；地上部鲜重在显著性水平5%和1%时脂肽类生物农药乳油各处理与清水对照均有显著性差异。

表2 脂肽类生物农药乳油对油菜生长的影响Table 2 Effects of biopesticides of lipopeptide on the growth of rape in field

3 讨论与结论

芽胞杆菌属于植物根围促生细菌（Plant growthpromoting rhizobacteria，PGPR），其通过成功定殖至植物根际、体表或体内，与病原菌竞争生存空间和营养物质，还能分泌抗菌物质以抑制病原菌生长，同时诱导植物产生系统抗性抵御病原菌入侵，从而起到生防作用。目前，在国内外商品化的芽胞杆菌生防制剂中都是直接利用菌体作为活性物质，生防效果不稳定，易受到环境因素影响。芽胞杆菌防治植物病害主要的生防机制是产生拮抗物质。自Johnson等报道芽胞杆菌能产生抗菌物质以来[12]，研究者从芽胞杆菌中发现60多种拮抗物质，而最主要的拮抗物质就是通过非核糖体途径合成脂肽类化合物，根据其结构上的差异分为Surfactin、Iturins和Fengycin三类。本研究直接利用芽胞杆菌代谢产物脂肽类化合物防治油菜菌核病，检测脂肽类化合物在实验室和田间防治效果。

脂肽类生物农药乳油B3和G4对油菜菌核病的平板拮抗试验表明，B3和G4与核盘菌形成明显拮抗圈（见图1），当B3和G4与核盘菌菌落接触后，核盘菌菌落停止生长，对照则长满整个平板。油菜离体叶片接种试验中，脂肽类生物农药乳油B3和G4处理油菜叶片后接种核盘菌，B3和G4对核盘菌在叶片上的侵染和扩展有较强抑制作用，尤其是B3处理完全抑制核盘菌侵染（见图2）。在田间试验中，经过不同处理后的油菜病株率和病情指数都大大低于对照。其中，B3处理最高防效达55.8%，显著高于克菌净防效（见表1），说明脂肽类生物农药乳油B3和G4在田间条件下能对核盘菌定殖和生长起抑制作用。先前研究表明，B3菌株能够产生脂肽类化合物Iturins和Fengycin，G4菌株能够产生脂肽类化合物Surfactin、Iturins和Fengycin，其中Iturins和Fengycin都具有很强的抑制真菌的活性[13]。因此，本试验认为脂肽类生物农药对油菜菌核病的防治主要是由于Iturins和Fengycin对油菜菌核病原菌的抑制作用。试验表明，脂肽类生物农药乳油对环境和作物安全，未发生药害现象且具有显著促生效果（见表2）。

在植物病害生物防治领域中，利用生防菌及其产生的抗菌物质是生物防治的重要研究内容。目前，直接利用芽胞杆菌产生脂肽类化合物防治植物病害还未见报道，因此该研究将有助于新型环保型生物源农药开发和研制。

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